Jeta në temperatura të larta vërehet in vitro me nanogrimca ari të ngrohura me lazer

Faleminderit që vizituat Nature.com. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS. Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer). Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta bëjmë faqen pa stile dhe JavaScript.
Termofilet janë mikroorganizma që lulëzojnë në temperatura të larta. Studimi i tyre mund të japë informacion të vlefshëm se si jeta përshtatet me kushtet ekstreme. Megjithatë, është e vështirë të arrihen kushte të temperaturës së lartë me mikroskopët optikë konvencionalë. Janë propozuar disa zgjidhje të bëra në shtëpi të bazuara në ngrohjen elektrike rezistente lokale, por nuk ka zgjidhje të thjeshtë komerciale. Në këtë punim, ne prezantojmë konceptin e ngrohjes me lazer në shkallë të vogël mbi fushën e shikimit të mikroskopit për të siguruar temperatura të larta për studimet termofile duke e mbajtur të butë mjedisin e përdoruesit. Ngrohja në mikroshkallë me intensitet të moderuar lazer mund të arrihet duke përdorur një substrat të veshur me nanogrimca ari si një absorbues drite biokompatibël dhe efikas. Diskutohen efektet e mundshme të konvekcionit të lëngut në shkallë të vogël, mbajtjes së qelizave dhe lëvizjes termoforetike centrifugale. Metoda është demonstruar në dy lloje: (i) Geobacillus stearothermophilus, një bakter aktiv termofilik që riprodhohet në rreth 65°C, i cili ne kemi vërejtur se mbin, rritet dhe noton nën ngrohje në shkallë mikro; (ii) Thiobacillus sp., një arkeë hipertermofile optimale. në 80°C. Kjo punë i hap rrugën vëzhgimit të thjeshtë dhe të sigurt të mikroorganizmave termofile duke përdorur mjete mikroskopike moderne dhe të përballueshme.
Gjatë miliarda viteve, jeta në Tokë ka evoluar për t'u përshtatur me një gamë të gjerë kushtesh mjedisore që ndonjëherë konsiderohen ekstreme nga këndvështrimi ynë njerëzor. Në veçanti, disa mikroorganizma termofilë (baktere, arkea, kërpudha) të quajtura termofile lulëzojnë në intervalin e temperaturave nga 45°C deri në 122°C1, 2, 3, 4. Termofilet jetojnë në ekosisteme të ndryshme, si shfrynimet hidrotermale të detit të thellë, burimet e nxehta. ose zona vullkanike. Hulumtimi i tyre ka gjeneruar shumë interes gjatë dekadave të fundit për të paktën dy arsye. Së pari, ne mund të mësojmë prej tyre, për shembull, se si termofilët 5, 6, enzimat 7, 8 dhe membranat 9 janë të qëndrueshme në temperatura kaq të larta, ose se si termofilet mund t'i rezistojnë niveleve ekstreme të rrezatimit10. Së dyti, ato janë baza për shumë aplikime të rëndësishme bioteknologjike1,11,12 si prodhimi i karburantit13,14,15,16, sinteza kimike (dihidro, alkoole, metan, aminoacide, etj.)17, biominimi18 dhe biokatalizatorët termostabilë7,11, 13. Në veçanti, reaksioni zinxhir i polimerazës (PCR)19 i njohur aktualisht përfshin një enzimë (Taq polimeraza) e izoluar nga bakteri termofilik Thermus aquaticus, një nga termofilët e parë që u zbulua.
Megjithatë, studimi i termofilëve nuk është një detyrë e lehtë dhe nuk mund të improvizohet në asnjë laborator biologjik. Në veçanti, termofilet e gjalla nuk mund të vëzhgohen in vitro me ndonjë mikroskop standard të dritës, madje edhe me dhomat e ngrohjes të disponueshme në treg, zakonisht të vlerësuara për temperatura deri në 40°C. Që nga vitet 1990, vetëm disa grupe kërkimore i janë përkushtuar futjes së sistemeve të mikroskopisë me temperaturë të lartë (HTM). Në 1994 Glukh et al. Dhoma e ngrohjes/ftohjes u konceptua bazuar në përdorimin e një qelize Peltier që kontrollon temperaturën e kapilarëve drejtkëndëshe të mbyllura për të ruajtur anaerobicitetin 20 . Pajisja mund të nxehet deri në 100 °C me një shpejtësi prej 2 °C/s, duke i lejuar autorët të studiojnë lëvizshmërinë e bakterit hipertermofilik Thermotoga maritima21. Në 1999 Horn et al. Një pajisje shumë e ngjashme është zhvilluar, ende e bazuar në përdorimin e kapilarëve të nxehtë të përshtatshëm për mikroskopi komerciale për të studiuar ndarjen/lidhjen qelizore. Pas një periudhe të gjatë pasiviteti relativ, kërkimi për HTM efektive rifilloi në vitin 2012, veçanërisht në lidhje me një seri letrash nga grupi Wirth që përdorte një pajisje të shpikur nga Horn et al. Pesëmbëdhjetë vjet më parë, lëvizshmëria e një numri të madh arkeash, duke përfshirë hipertermofile, u studiua në temperatura deri në 100°C duke përdorur kapilarët e nxehur23,24. Ata modifikuan gjithashtu mikroskopin origjinal për të arritur ngrohje më të shpejtë (disa minuta në vend të 35 minutave për të arritur temperaturën e caktuar) dhe për të arritur një gradient të temperaturës lineare prej më shumë se 2 cm në të gjithë mediumin. Kjo pajisje për formësimin e gradientit të temperaturës (TGFD) është përdorur për të studiuar lëvizshmërinë e shumë termofilëve brenda gradientëve të temperaturës në distanca të rëndësishme biologjikisht 24, 25 .
Ngrohja e kapilarëve të mbyllur nuk është mënyra e vetme për të vëzhguar termofilët e gjallë. Në vitin 2012, Kuwabara et al. Janë përdorur dhomat e njëpërdorimshme Pyrex të bëra në shtëpi të mbyllura me ngjitës rezistent ndaj nxehtësisë (Super X2; Cemedine, Japoni). Mostrat u vendosën në një pllakë ngrohëse transparente të disponueshme në treg (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japoni) e aftë për t'u ngrohur deri në 110°C, por jo e destinuar fillimisht për bioimazhim. Autorët vëzhguan ndarjen efikase të baktereve termofile anaerobe (Thermosipho globiformans, koha e dyfishimit 24 min) në 65°C. Në vitin 2020, Pulshen et al. Ngrohja efikase e enëve metalike komerciale (AttofluorTM, Thermofisher) u demonstrua duke përdorur dy elementë ngrohës të bërë vetë: një kapak dhe një skenë (konfigurim i frymëzuar nga makina PCR). Kjo lidhje rezulton në një temperaturë të njëtrajtshme të lëngut dhe parandalon avullimin dhe kondensimin në fund të kapakut. Përdorimi i një unaze O shmang shkëmbimin e gazit me mjedisin. Ky HTM, i quajtur Sulfoskop, u përdor për të imazhuar Sulfolobus acidocaldarius në 75°C27.
Një kufizim i njohur i të gjitha këtyre sistemeve ishte kufizimi në përdorimin e objektivave të ajrit, ku çdo zhytje e vajit nuk ishte e përshtatshme për një temperaturë kaq të lartë dhe për imazhe përmes mostrave transparente të trasha >1 mm. Një kufizim i njohur i të gjitha këtyre sistemeve ishte kufizimi në përdorimin e objektivave të ajrit, ku çdo zhytje e vajit nuk ishte e përshtatshme për një temperaturë kaq të lartë dhe për imazhe përmes mostrave transparente të trasha >1 mm. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничени на користење воздушных объективов, поскольку любое иммерсионное погружение во масло не подходило для такой высокизациой температурни и для резы 1 mm. Një mangësi e njohur e të gjitha këtyre sistemeve ishte kufizimi në përdorimin e objektivave të ajrit, pasi çdo zhytje e vajit nuk ishte e përshtatshme për një temperaturë kaq të lartë dhe për vizualizimin përmes mostrave transparente me trashësi > 1 mm.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合毫米厚的透明样品成像. Një kufizim i njohur i të gjitha këtyre sistemeve është kufizimi i përdorimit të një pasqyre me ajër, pasi çdo zhytje e vajit është e papërshtatshme për imazhin e mostrave transparente të trasha >1 mm në temperatura kaq të larta. Njohuri i pamjaftueshëm i të gjitha sistemeve është i kufizuar në përdorimin e ajrit të jashtëm, i keqkuptuar nga përdorimi i pakët i temperaturës dhe vizualizimi i tyre >1. Një pengesë e njohur e të gjitha këtyre sistemeve është përdorimi i kufizuar i lenteve të ajrit, çdo zhytje e vajit është e papërshtatshme për temperatura të tilla të larta dhe vizualizimi përmes mostrave transparente >1 mm të trasha.Kohët e fundit, ky kufizim u hoq nga Charles-Orzag et al. 28, i cili zhvilloi një pajisje që nuk siguron më nxehtësi rreth sistemit të interesit, por më tepër brenda xhamit të kapakut, të mbuluar me një shtresë të hollë transparente të një rezistence të bërë nga ITO (oksid indium-kallaj). Kapaku mund të nxehet deri në 75 °C duke kaluar një rrymë elektrike përmes shtresës transparente. Megjithatë, autori duhet të ngrohë edhe thjerrëzën në objektiv, por jo më shumë se 65 °C, për të mos e dëmtuar atë.
Këto punime tregojnë se zhvillimi i mikroskopisë optike efikase të temperaturës së lartë nuk është miratuar gjerësisht, shpesh kërkon pajisje shtëpiake dhe shpesh arrihet me koston e zgjidhjes hapësinore, gjë që është një disavantazh serioz duke pasur parasysh se mikroorganizmat termofilë nuk janë më të mëdhenj se disa. mikrometra. Vëllimi i reduktuar i ngrohjes është çelësi për zgjidhjen e tre problemeve të qenësishme të HTM: rezolucion i dobët hapësinor, inerci e lartë termike kur sistemi nxehet dhe ngrohja e dëmshme e elementeve përreth (vaji i zhytjes, lentet objektive… ose duart e përdoruesit) në temperatura ekstreme. ).
Në këtë punim, ne prezantojmë një HTM për vëzhgimin termofile që nuk bazohet në ngrohjen rezistente. Në vend të kësaj, ne arritëm ngrohje të lokalizuar brenda një zone të kufizuar të fushës së shikimit të mikroskopit nga rrezatimi me lazer i një nënshtrese që thith dritën. Shpërndarja e temperaturës u vizualizua duke përdorur mikroskopin sasior të fazës (QPM). Efektiviteti i kësaj metode demonstrohet nga Geobacillus stearothermophilus, një bakter termofilik i lëvizshëm që riprodhohet në rreth 65°C dhe ka një kohë të shkurtër dyfishimi (rreth 20 minuta) dhe Sulfolobus shibatae, një hipertermofil që rritet në mënyrë optimale në 80°C (archae) për të ilustruar. Shpejtësia normale e replikimit dhe noti u vëzhguan në funksion të temperaturës. Ky HTM lazer (LA-HTM) nuk kufizohet nga trashësia e mbulesës ose nga natyra e objektivit (zhytja në ajër ose vaj). Kjo lejon përdorimin e çdo lente me rezolucion të lartë në treg. Gjithashtu nuk vuan nga ngrohja e ngadaltë për shkak të inercisë termike (arrin ngrohje të menjëhershme në një shkallë milisekonda) dhe përdor vetëm përbërës të disponueshëm në treg. Të vetmet shqetësime të reja të sigurisë lidhen me praninë e rrezeve të fuqishme lazer (zakonisht deri në 100 mW) brenda pajisjes dhe ndoshta përmes syve, të cilat kërkojnë syze mbrojtëse.
Parimi i LA-HTM është përdorimi i një lazeri për të ngrohur kampionin lokalisht brenda fushës së shikimit të mikroskopit (Fig. 1a). Për ta bërë këtë, mostra duhet të jetë thithëse e dritës. Për të përdorur një fuqi të arsyeshme lazer (më pak se 100 mW), ne nuk u mbështetëm në thithjen e dritës nga mjedisi i lëngshëm, por rritëm artificialisht thithjen e kampionit duke e veshur nënshtresën me nanogrimca ari (Fig. 1c). Ngrohja e nanogrimcave të arit me dritë ka një rëndësi thelbësore në fushën e plazmonikës termike, me aplikime të pritshme në biomjekësi, nanokimi ose mbledhjen e dritës së diellit29,30,31. Gjatë viteve të fundit, ne e kemi përdorur këtë LA-HTM në disa studime në lidhje me aplikimet termike të plazmës në fizikë, kimi dhe biologji. Vështirësia kryesore me këtë metodë është në shfaqjen e profilit përfundimtar të temperaturës, pasi temperatura e ngritur është e kufizuar në një rajon mikroshkallëz brenda kampionit. Ne kemi treguar se hartëzimi i temperaturës mund të arrihet me interferometrin e prerjes tërthore me katër gjatësi vale, një metodë e thjeshtë, me rezolucion të lartë dhe shumë të ndjeshme të mikroskopisë sasiore të fazës bazuar në përdorimin e grilave dydimensionale të difraksionit (të njohura edhe si grila tërthore) 33,34,35,36. Besueshmëria e kësaj teknike të mikroskopisë termike, e bazuar në mikroskopin e frontit të valës me rrjetë të kryqëzuar (CGM), është demonstruar në një duzinë punimesh të botuara gjatë dekadës së fundit37,38,39,40,41,42,43.
Skema e instalimit të mikroskopit të ngrohjes paralele me laser, formësimit dhe temperaturës. b Gjeometria e mostrës që përbëhet nga një dhomë AttofluorTM që përmban një mbulesë të veshur me nanogrimca ari. c Shikoni nga afër kampionin (jo në shkallë). d përfaqëson profilin uniform të rrezes lazer dhe (e) shpërndarjen e simuluar të temperaturës pasuese në planin kampion të nanogrimcave të arit. f është një profil unazor i rrezes lazer i përshtatshëm për të gjeneruar një temperaturë uniforme siç tregohet në simulimin e shpërndarjes së temperaturës që rezulton në (g). Shiriti i shkallës: 30 µm.
Në veçanti, kohët e fundit kemi arritur ngrohjen e qelizave të gjitarëve me LA-HTM dhe CGM dhe kemi gjurmuar përgjigjet qelizore të goditjes termike në intervalin 37-42°C, duke demonstruar zbatueshmërinë e kësaj teknike në imazhin e një qelize të vetme të gjallë. Megjithatë, aplikimi i LA-HTM për studimin e mikroorganizmave në temperatura të larta nuk është i paqartë, pasi kërkon më shumë kujdes në krahasim me qelizat e gjitarëve: së pari, ngrohja e pjesës së poshtme të mediumit me dhjetëra gradë (në vend se disa gradë) çon. në një gradient të fortë vertikal të temperaturës. mund të krijojë konvekcion të lëngut 44 i cili, nëse nuk ngjitet fort me nënshtresën, mund të shkaktojë lëvizje dhe përzierje të padëshirueshme të baktereve. Kjo konvekcion mund të eliminohet duke zvogëluar trashësinë e shtresës së lëngshme. Për këtë qëllim, në të gjitha eksperimentet e paraqitura më poshtë, suspensionet bakteriale u vendosën midis dy mbulesave me trashësi afërsisht 15 µm të vendosura brenda një filxhani metalik (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c). Në parim, konvekcioni mund të shmanget nëse trashësia e lëngut është më e vogël se madhësia e rrezes së lazerit ngrohës. Së dyti, puna në një gjeometri kaq të kufizuar mund të mbysë organizmat aerobikë (shih Fig. S2). Ky problem mund të shmanget duke përdorur një nënshtresë që është e përshkueshme nga oksigjeni (ose ndonjë gaz tjetër jetik), duke lënë flluska ajri të bllokuara brenda mbulesës, ose duke shpuar vrima në mbulesën e sipërme (shih Fig. S1) 45 . Në këtë studim, ne zgjodhëm zgjidhjen e fundit (Figura 1b dhe S1). Së fundi, ngrohja me lazer nuk siguron shpërndarje uniforme të temperaturës. Edhe në të njëjtin intensitet të rrezes lazer (Fig. 1d), shpërndarja e temperaturës nuk është uniforme, por më tepër i ngjan shpërndarjes Gaussian për shkak të difuzionit termik (Fig. 1e). Kur qëllimi është vendosja e temperaturave të sakta në fushën e shikimit për studimin e sistemeve biologjike, profilet e pabarabarta nuk janë ideale dhe gjithashtu mund të çojnë në lëvizje termoforetike të baktereve nëse ato nuk ngjiten në substrat (shih Fig. S3, S4)39. Për këtë qëllim, ne përdorëm një modulator të dritës hapësinore (SLM) për të formuar rreze lazer infra të kuqe sipas formës së unazës (Fig. 1f) në rrafshin e kampionit për të arritur një shpërndarje të përkryer uniforme të temperaturës brenda një zone të caktuar gjeometrike, pavarësisht difuzionit termik (Fig. 1d) 39, 42, 46. Vendosni një kapak të sipërm mbi një enë metalike (Figura 1b) për të shmangur avullimin e mediumit dhe vëzhgojeni për të paktën disa ditë. Për shkak se kjo mbulesë e sipërme nuk është e mbyllur, medium shtesë mund të shtohet lehtësisht në çdo kohë nëse është e nevojshme.
Për të ilustruar se si funksionon LA-HTM dhe për të demonstruar zbatueshmërinë e tij në kërkimin termofilik, ne studiuam bakteret aerobike Geobacillus stearothermophilus, të cilat kanë një temperaturë optimale të rritjes rreth 60-65°C. Bakteri gjithashtu ka flagjela dhe aftësi për të notuar, duke siguruar një tjetër tregues të aktivitetit normal qelizor.
Mostrat (Fig. 1b) u inkubuan paraprakisht në 60°C për një orë dhe më pas u vendosën në një mbajtës kampioni LA-HTM. Ky para-inkubacion është opsional, por gjithsesi i dobishëm, për dy arsye: Së pari, kur lazeri është i ndezur, ai bën që qelizat të rriten dhe ndahen menjëherë (shih filmin M1 te Materialet Suplementare). Pa inkubacion paraprak, rritja bakteriale zakonisht vonohet me rreth 40 minuta sa herë që nxehet një zonë e re shikimi në mostër. Së dyti, 1 orë para inkubacionit nxiti ngjitjen e baktereve në mbulesën, duke parandaluar që qelizat të largohen nga fusha e shikimit për shkak të termoforezës kur lazeri u ndez (shih filmin M2 te Materialet Suplementare). Termoforeza është lëvizja e grimcave ose molekulave përgjatë një gradienti të temperaturës, zakonisht nga e nxehta në të ftohtë, dhe bakteret nuk bëjnë përjashtim43,47. Ky efekt i padëshirueshëm eliminohet në një zonë të caktuar duke përdorur SLM për të formësuar rreze lazer dhe për të arritur një shpërndarje të sheshtë të temperaturës.
Në fig. Figura 2 tregon shpërndarjen e temperaturës të matur nga CGM e përftuar nga rrezatimi i një nënshtrese xhami të veshur me nanogrimca ari me një rreze lazer unazore (Fig. 1f). Një shpërndarje e sheshtë e temperaturës u vu re në të gjithë zonën e mbuluar nga rreze lazer. Kjo zonë u vendos në 65°C, temperatura optimale e rritjes. Jashtë këtij rajoni, kurba e temperaturës natyrisht bie në \(1/r\) (ku \(r\) është koordinata radiale).
një hartë e temperaturës së matjeve CGM e marrë duke përdorur një rreze lazer unazore për të rrezatuar një shtresë nanogrimcash ari për të marrë një profil të sheshtë të temperaturës mbi një zonë rrethore. b Izotermia e hartës së temperaturës (a). Kontura e rrezes lazer përfaqësohet nga një rreth gri me pika. Eksperimenti u përsërit dy herë (shih Materialet Suplementare, Figura S4).
Qëndrueshmëria e qelizave bakteriale u monitorua për disa orë duke përdorur LA-HTM. Në fig. 3 tregon intervalin kohor për katër imazhe të marra nga një film 3 orë 20 minuta (Film M3, Informacion shtesë). U vu re se bakteret përhapeshin në mënyrë aktive brenda zonës rrethore të përcaktuar nga lazeri ku temperatura ishte optimale, duke iu afruar 65°C. Në të kundërt, rritja e qelizave u zvogëlua ndjeshëm kur temperatura ra nën 50 ° C për 10 s.
Imazhet e thellësisë optike të baktereve G. stearothermophilus që rriten pas ngrohjes me lazer në kohë të ndryshme, (a) t = 0 min, (b) 1 orë 10 min, (c) 2 orë 20 min, (d) 3 orë 20 min, jashtë 200 Nxjerrë nga një film një minutësh (filmi M3 i dhënë në Informacion shtesë) i mbivendosur në hartën përkatëse të temperaturës. Lazeri ndizet në momentin \(t=0\). Izotermat janë shtuar në imazhin e intensitetit.
Për të përcaktuar më tej rritjen e qelizave dhe varësinë e saj nga temperatura, ne matëm rritjen e biomasës së kolonive të ndryshme të baktereve të izoluara fillimisht në fushën e shikimit të Filmit M3 (Fig. 4). Bakteret mëmë të zgjedhura në fillimin e formimit të njësisë së formimit të mini kolonive (mCFU) janë paraqitur në Figurën S6. Matjet e masës së thatë u morën me një kamerë CGM 48 e cila u përdor për të hartuar shpërndarjen e temperaturës. Aftësia e CGM për të matur peshën dhe temperaturën e thatë është forca e LA-HTM. Siç pritej, temperatura e lartë shkaktoi rritje më të shpejtë të baktereve (Fig. 4a). Siç tregohet në grafikun gjysmë-log në Fig. 4b, rritja në të gjitha temperaturat pason rritjen eksponenciale, ku të dhënat përdorin funksionin eksponencial \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), ku \(\tau {{{{{{\rm{log }}}}}}2\) – koha e gjenerimit (ose koha e dyfishimit), \( g =1/ \tau\) – shkalla e rritjes (numri i ndarjeve për njësi të kohës ). Në fig. 4c tregon shkallën përkatëse të rritjes dhe kohën e gjenerimit në funksion të temperaturës. MCFU-të me rritje të shpejtë karakterizohen nga ngopja e rritjes pas dy orësh, një sjellje e pritshme për shkak të densitetit të lartë bakterial (i ngjashëm me fazën stacionare në kulturat klasike të lëngshme). Forma e përgjithshme \(g\majtas(T\djathtas)) (Fig. 4c) korrespondon me lakoren e pritur dyfazore për G. stearothermophilus me një normë optimale rritjeje rreth 60-65°C. Përputhni të dhënat duke përdorur një model kardinal (Figura S5)49 ku \(\majtas({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\djathtas)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, që përputhet mirë me vlerat e tjera të cituara në literaturë49. Megjithëse parametrat e varur nga temperatura janë të riprodhueshme, shkalla maksimale e rritjes së \({G}_{0}\) mund të ndryshojë nga një eksperiment në tjetrin (shih figurat S7-S9 dhe filmin M4). Ndryshe nga parametrat e përshtatjes së temperaturës, të cilat duhet të jenë universale, shkalla maksimale e rritjes varet nga vetitë e mediumit (disponueshmëria e lëndëve ushqyese, përqendrimi i oksigjenit) brenda gjeometrisë së vëzhguar në shkallë të vogël.
Një rritje mikrobike në temperatura të ndryshme. mCFU: Njësitë e formimit të kolonive në miniaturë. Të dhënat e marra nga një video e një bakteri të vetëm që rritet në një gradient të temperaturës (filmi M3). b Njësoj si (a), shkalla gjysmë logaritmike. c Shkalla e rritjes\(\tau\) dhe koha e gjenerimit\(g\) llogaritur nga regresioni linear (b). Shiritat e gabimit horizontal: diapazoni i temperaturës mbi të cilin mCFU-të u zgjeruan në fushën e shikimit gjatë rritjes. Shiritat vertikal të gabimit: gabim standard i regresionit linear.
Përveç rritjes normale, disa baktere ndonjëherë dilnin në pamje gjatë ngrohjes me lazer, gjë që është një sjellje e pritshme për bakteret me flagjela. Filmi M5 në informacione shtesë tregon aktivitete të tilla noti. Në këtë eksperiment, rrezatimi uniform lazer u përdor për të krijuar një gradient të temperaturës, siç tregohet në figurat 1d, e dhe S3. Figura 5 tregon dy sekuenca imazhesh të zgjedhura nga filmi M5 që tregojnë se një bakter shfaq lëvizje drejtimi ndërsa të gjitha bakteret e tjera mbeten të palëvizshme.
Dy kornizat kohore (a) dhe (b) tregojnë notin e dy baktereve të ndryshme të shënuara me rrathë me pika. Imazhet janë nxjerrë nga filmi M5 (siguruar si material plotësues).
Në rastin e G. stearothermophilus, lëvizja aktive e baktereve (Fig. 5) filloi disa sekonda pasi u ndez rrezja lazer. Ky vëzhgim thekson përgjigjen kohore të këtij mikroorganizmi termofilik ndaj një rritje të temperaturës, siç është vërejtur tashmë nga Mora et al. 24 . Tema e lëvizshmërisë bakteriale dhe madje edhe termotaksia mund të hulumtohet më tej duke përdorur LA-HTM.
Noti mikrobial nuk duhet të ngatërrohet me llojet e tjera të lëvizjes fizike, përkatësisht (i) lëvizjen Browniane, e cila duket të jetë lëvizje kaotike pa drejtim të caktuar, (ii) konvekcioni 50 dhe termoforeza 43, që konsiston në një lëvizje të rregullt lëvizjeje përgjatë një temperature. gradient.
G. stearothermophilus është i njohur për aftësinë e tij për të prodhuar spore shumë rezistente (formimi i sporeve) kur ekspozohet ndaj kushteve të pafavorshme mjedisore si mbrojtje. Kur kushtet mjedisore bëhen sërish të favorshme, sporet mbijnë, duke formuar qeliza të gjalla dhe duke rifilluar rritjen. Edhe pse ky proces sporulimi/mbirjeje është i njohur mirë, ai nuk është vërejtur kurrë në kohë reale. Duke përdorur LA-HTM, ne raportojmë këtu vëzhgimin e parë të ngjarjeve të mbirjes në G. stearothermophilus.
Në fig. 6a tregon imazhe me kalim kohe të thellësisë optike (OT) të marra duke përdorur një grup CGM prej 13 sporesh. Për të gjithë kohën e grumbullimit (15 h 6 min, \(t=0\) – fillimi i ngrohjes me lazer), 4 nga 13 spore mbijnë, në pikat e njëpasnjëshme kohore \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' dhe \(11\) h \(30\)'. Edhe pse vetëm një nga këto ngjarje është paraqitur në Figurën 6, 4 ngjarje mbirjes mund të vërehen në filmin M6 në materialin plotësues. Interesante, mbirja duket të jetë e rastësishme: jo të gjitha sporet mbijnë dhe nuk mbijnë në të njëjtën kohë, pavarësisht të njëjtave ndryshime në kushtet e mjedisit.
një "Time-lapse" i përbërë nga 8 imazhe OT (zhytje me vaj, 60x, objektivi 1.25 NA) dhe (b) evolucioni i biomasës së agregateve G. stearothermophilus. c (b) Vizatuar në një shkallë gjysmë-log për të theksuar linearitetin e normës së rritjes (vijë e ndërprerë).
Në fig. 6b,c tregon biomasën e popullatave qelizore në fushën e shikimit në funksion të kohës gjatë gjithë periudhës së mbledhjes së të dhënave. Prishja e shpejtë e masës së thatë e vërejtur në \(t=5\)h në fig. 6b, c, për shkak të daljes së disa qelizave nga fusha e shikimit. Shkalla e rritjes së këtyre katër ngjarjeve është \(0.77\pm 0.1\) h-1. Kjo vlerë është më e lartë se shkalla e rritjes e lidhur me figurën 3. 3 dhe 4, ku qelizat rriten normalisht. Arsyeja për rritjen e shkallës së rritjes së G. stearothermophilus nga sporet është e paqartë, por këto matje nxjerrin në pah interesin e LA-HTM dhe punojnë në nivelin e një qelize të vetme (ose në nivelin e vetëm mCFU) për të mësuar më shumë rreth dinamikës së jetës së qelizave .
Për të demonstruar më tej shkathtësinë e LA-HTM dhe performancën e tij në temperatura të larta, ne ekzaminuam rritjen e Sulfolobus shibatae, një arkeë acidofile hipertermofile me një temperaturë optimale të rritjes 80°C51. Krahasuar me G. stearothermophilus, këto arkea kanë gjithashtu një morfologji shumë të ndryshme, që i ngjajnë sferave 1 mikron (koke) dhe jo shufrave të zgjatura (bacileve).
Figura 7a përbëhet nga imazhe sekuenciale të thellësisë optike të S. shibatae mCFU të marra duke përdorur CGM (shih filmin artistik M7 te Materialet Suplementare). Ky mCFU rritet në rreth 73°C, nën temperaturën optimale prej 80°C, por brenda intervalit të temperaturës për rritje aktive. Ne vëzhguam ngjarje të shumta të ndarjes që i bënë mCFU-të të dukeshin si mikrorrush arkeash pas disa orësh. Nga këto imazhe OT, biomasa mCFU u mat me kalimin e kohës dhe u prezantua në Figurën 7b. Është interesante se mCFU-të e S. shibatae treguan rritje lineare në vend të rritjes eksponenciale të parë me mCFU-të G. stearothermophilus. Ka pasur një diskutim të gjatë 52 për natyrën e ritmeve të rritjes së qelizave: ndërsa disa studime raportojnë ritme të rritjes së mikrobeve që janë proporcionale me madhësinë e tyre (rritje eksponenciale), të tjera tregojnë një normë konstante (rritje lineare ose bilineare). Siç shpjegohet nga Tzur et al.53, dallimi midis rritjes eksponenciale dhe (bi)lineare kërkon një saktësi prej <6% në matjet e biomasës, e cila është e paarritshme për shumicën e teknikave QPM, madje edhe duke përfshirë interferometrinë. Siç shpjegohet nga Tzur et al.53, dallimi midis rritjes eksponenciale dhe (bi)lineare kërkon një saktësi prej <6% në matjet e biomasës, e cila është e paarritshme për shumicën e teknikave QPM, madje edhe duke përfshirë interferometrinë. Si mund të përshkruhen Cur dhe dr.53, zvarritje эksponenciale dhe (bi)lineynogo rosta do të thotë saktësi <6% në ndryshimin e biomassы, që është i pamjaftueshëm për metodat më të mira të QPM, duke përdorur interferometritë e përdorura. Siç shpjegohet nga Zur et al.53, dallimi midis rritjes eksponenciale dhe (bi)lineare kërkon saktësi <6% në matjet e biomasës, e cila është e paarritshme për shumicën e metodave QPM, edhe duke përdorur interferometrinë.Siç shpjegohet nga Zur et al. 53, dallimi midis rritjes eksponenciale dhe (bi)lineare kërkon më pak se 6% saktësi në matjet e biomasës, e cila është e paarritshme për shumicën e metodave QPM, edhe kur përdoret interferometria. CGM e arrin këtë saktësi me saktësinë nën-pg në matjet e biomasës36,48.
një kalim kohe i përbërë nga 6 imazhe OT (zhytje në vaj, 60x, objektivi NA 1.25) dhe (b) evolucioni i biomasës mikro-CFU i matur me CGM. Shikoni filmin M7 për më shumë informacion.
Rritja krejtësisht lineare e S. shibatae ishte e papritur dhe ende nuk është raportuar. Megjithatë, pritet një rritje eksponenciale, të paktën sepse me kalimin e kohës, duhet të ndodhin ndarje të shumëfishta të qelizave 2, 4, 8, 16 .... Ne supozuam se rritja lineare mund të jetë për shkak të frenimit të qelizave për shkak të paketimit të dendur të qelizave, ashtu si rritja e qelizave ngadalësohet dhe përfundimisht arrin një gjendje të fjetur kur dendësia e qelizave është shumë e lartë.
Ne përfundojmë duke diskutuar pesë pikat e mëposhtme të interesit me radhë: reduktimin e vëllimit të ngrohjes, reduktimin e inercisë termike, interesin për nanogrimcat e arit, interesin në mikroskopinë sasiore të fazës dhe një gamë të mundshme të temperaturës në të cilën mund të përdoret LA-HTM.
Krahasuar me ngrohjen rezistente, ngrohja me lazer e përdorur për zhvillimin e HTM ofron disa përparësi, të cilat i ilustrojmë në këtë studim. Në veçanti, në mediat e lëngëta në fushën e shikimit të mikroskopit, vëllimi i ngrohjes mbahet brenda disa (10 μm) 3 vëllimesh. Në këtë mënyrë, vetëm mikrobet e vëzhguara janë aktive, ndërsa bakteret e tjera janë të fjetura dhe mund të përdoren për të studiuar më tej kampionin - nuk ka nevojë të ndryshohet kampioni sa herë që duhet të kontrollohet një temperaturë e re. Përveç kësaj, ngrohja në shkallë të vogël lejon ekzaminimin e drejtpërdrejtë të një gamë të madhe temperaturash: Figura 4c është marrë nga një film 3-orësh (Filmi M3), i cili zakonisht kërkon përgatitjen dhe ekzaminimin e disa mostrave - një për secilën nga mostrat në studim. y është temperatura që përfaqëson numrin e ditëve në eksperiment. Reduktimi i volumit të nxehtë mban gjithashtu të gjithë përbërësit optikë përreth të mikroskopit, veçanërisht thjerrëzën objektive, në temperaturën e dhomës, gjë që ka qenë një problem i madh me të cilin është përballur komuniteti deri më tani. LA-HTM mund të përdoret me çdo lente, duke përfshirë lentet për zhytje në vaj, dhe do të qëndrojë në temperaturën e dhomës edhe me temperatura ekstreme në fushën e shikimit. Kufizimi kryesor i metodës së ngrohjes me lazer që raportojmë në këtë studim është se qelizat që nuk ngjiten ose notojnë mund të jenë larg fushës së shikimit dhe të vështira për t'u studiuar. Një zgjidhje mund të jetë përdorimi i lenteve me zmadhim të ulët për të arritur një rritje më të madhe të temperaturës mbi disa qindra mikronë. Ky kujdes shoqërohet me një ulje të rezolucionit hapësinor, por nëse qëllimi është të studiohet lëvizja e mikroorganizmave, nuk kërkohet rezolucion i lartë hapësinor.
Shkalla kohore për ngrohjen (dhe ftohjen) e sistemit \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) varet nga madhësia e tij, sipas ligjit \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), ku \ (L\ ) është madhësia karakteristike e burimit të nxehtësisë (diametri i rrezes lazer në studimin tonë është \(L\ rreth 100\) μm), \(D\) është difuziviteti termik i mjedisit (mesatarja në tonë rasti, qelqi dhe uji Shpejtësia e difuzionit\(D\ rreth 2\fish {10}^{-7}\) m2/s. Prandaj, në këtë studim, përgjigjet kohore të rendit 50 ms, d.m.th., pothuajse të menjëhershme). ndryshimet e temperaturës, mund të priten Ky vendosje e menjëhershme e rritjes së temperaturës jo vetëm që shkurton kohëzgjatjen e eksperimentit, por gjithashtu lejon kohën e saktë \(t=0\) për çdo studim dinamik të efekteve të temperaturës.
Metoda jonë e propozuar është e zbatueshme për çdo substrat që thith dritën (për shembull, mostrat komerciale me veshje ITO). Megjithatë, nanogrimcat e arit janë në gjendje të sigurojnë absorbim të lartë në infra të kuqe dhe absorbim të ulët në diapazonin e dukshëm, karakteristikat e fundit të të cilave janë me interes për vëzhgim efektiv optik në diapazonin e dukshëm, veçanërisht kur përdoret fluoreshenca. Përveç kësaj, ari është biokompatibël, kimikisht inert, dendësia optike mund të rregullohet nga 530 nm në afërsi të infra të kuqes dhe përgatitja e mostrës është e thjeshtë dhe ekonomike29.
Mikroskopi me rrjetë tërthore të valës (CGM) lejon jo vetëm hartimin e temperaturës në shkallë mikro, por edhe monitorimin e biomasës, duke e bërë atë veçanërisht të dobishëm (nëse nuk është e nevojshme) në kombinim me LA-HTM. Gjatë dekadës së fundit, janë zhvilluar teknika të tjera të mikroskopisë së temperaturës, veçanërisht në fushën e bioimazhimit, dhe shumica e tyre kërkojnë përdorimin e sondave fluoreshente të ndjeshme ndaj temperaturës54,55. Megjithatë, këto metoda janë kritikuar dhe disa raporte kanë matur ndryshimet joreale të temperaturës brenda qelizave, ndoshta për shkak të faktit se fluoreshenca varet nga shumë faktorë të tjerë përveç temperaturës. Përveç kësaj, shumica e sondave fluoreshente janë të paqëndrueshme në temperatura të larta. Prandaj, QPM dhe në veçanti CGM përfaqësojnë një teknikë ideale të mikroskopisë së temperaturës për të studiuar jetën në temperatura të larta duke përdorur mikroskopin optik.
Studimet e S. shibatae, të cilat jetojnë në mënyrë optimale në 80°C, tregojnë se LA-HTM mund të aplikohet për të studiuar hipertermofile, jo vetëm termofile të thjeshtë. Në parim, nuk ka kufi për gamën e temperaturave që mund të arrihet duke përdorur LA-HTM, madje edhe temperaturat mbi 100°C mund të arrihen në presionin atmosferik pa zierje, siç tregohet nga grupi ynë prej 38 në aplikimet e kimisë hidrotermale në atmosferë. presioni A. Një lazer përdoret për ngrohjen e nanogrimcave të arit 40 në të njëjtën mënyrë. Kështu, LA-HTM ka potencialin për t'u përdorur për të vëzhguar hipertermofile të paprecedentë me mikroskop optik standard me rezolucion të lartë në kushte standarde (dmth. në stres mjedisor).
Të gjitha eksperimentet u kryen duke përdorur një mikroskop shtëpiak, duke përfshirë ndriçimin Köhler (me LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), mbajtësin e mostrës me lëvizje manuale xy, objektivat (Olympus, 60x, 0.7 NA, ajër, LUCPlanFLN60X ose 60x, NA1. , UPLFLN60XOI), kamera CGM (grirja e kryqëzuar QLSI, hapi 39 µm, 0,87 mm nga sensori i kamerës Andor Zyla) për të siguruar intensitetin dhe imazhin e valës, dhe kamera sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, modaliteti 16-bit , nga Hamamatsu) për të regjistruar të dhënat e paraqitura në figurën 5 (noti bakterial). Ndarësi dikroik i rrezeve është një skaj BrightLine 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). Filtri në pjesën e përparme të kamerës është një filtër me kalim të shkurtër 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Lazer safir titani (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, zgavër lazer i cunamit të pompuar, Spectra-Physics në Fig. 2-5, i zëvendësuar më tej nga lazeri Millenia, Spectraphysics 10 W, zgavra e laserit Mira e pompuar, Koherent2 për Fig. -5). 6 dhe 7) janë vendosur në gjatësinë e valës \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, e cila korrespondon me spektrin e rezonancës plazmonike të nanogrimcave të arit. Modulatorët e dritës hapësinore (1920 × 1152 piksele) janë blerë nga Meadowlark Optics.
Mikroskopia me anë të valës me rrjetë tërthore (CGM) është një teknikë e mikroskopisë optike e bazuar në kombinimin e një grilë difraksioni dydimensionale (e njohur edhe si grilë kryq) në një distancë prej një milimetri nga sensori i një kamere konvencionale. Shembulli më i zakonshëm i një CGM që kemi përdorur në këtë studim quhet një interferometër me zhvendosje tërthore me katër gjatësi vale (QLSI), ku grila e kryqëzuar përbëhet nga një model shahu me intensitet/fazë i prezantuar dhe i patentuar nga Primot et al. në vitin 200034. Linjat e rrjetës vertikale dhe horizontale krijojnë hije në formë rrjeti në sensor, shtrembërimi i të cilave mund të përpunohet numerikisht në kohë reale për të marrë shtrembërimin optik të ballit të valës (ose profilin ekuivalent të fazës) të dritës së rënë. Kur përdoret në një mikroskop, një aparat fotografik CGM mund të shfaqë ndryshimin e rrugës optike të një objekti të imazhit, i njohur gjithashtu si thellësia optike (OT), me një ndjeshmëri të rendit nanometra36. Në çdo matje CGM, për të eliminuar çdo defekt në komponentët optikë ose rrezet, duhet të merret një imazh parësor OT referencë dhe të zbritet nga çdo imazh pasues.
Mikroskopi i temperaturës u krye duke përdorur një kamerë CGM siç përshkruhet në referencë. 32. Me pak fjalë, ngrohja e një lëngu ndryshon indeksin e tij të thyerjes, duke krijuar një efekt lente termike që shtrembëron rrezen e rënë. Ky shtrembërim i frontit të valës matet nga CGM dhe përpunohet duke përdorur një algoritëm dekonvolucioni për të marrë një shpërndarje tredimensionale të temperaturës në mjedisin e lëngshëm. Nëse nanogrimcat e arit shpërndahen në mënyrë të barabartë në të gjithë kampionin, harta e temperaturës mund të bëhet në zona pa baktere për të prodhuar imazhe më të mira, gjë që bëjmë ndonjëherë. Imazhi i referencës CGM u mor pa ngrohje (me lazerin të fikur) dhe më pas u kap në të njëjtin vend në imazh me lazerin ndezur.
Matja e masës së thatë arrihet duke përdorur të njëjtën kamerë CGM që përdoret për imazhin e temperaturës. Imazhet e referencës CGM u morën duke lëvizur me shpejtësi kampionin në x dhe y gjatë ekspozimit si një mjet për të mesatarizuar çdo inhomogjenitet në OT për shkak të pranisë së baktereve. Nga imazhet OT të baktereve, biomasa e tyre u mor duke përdorur një grup imazhesh mbi zonat e zgjedhura duke përdorur algoritmin e segmentimit të bërë në shtëpi të Matlab (shih nënseksionin "Kodi numerik"), duke ndjekur procedurën e përshkruar në ref. 48. Shkurtimisht, ne përdorim relacionin \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), ku \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) është imazhi i thellësisë optike, \(m\) është pesha e thatë dhe \({{{{{\rm{\alfa }}}}}}\) është një konstante. Ne zgjodhëm \({{{{\rm{\alfa))))))=0,18\) μm3/pg, që është një konstante tipike për qelizat e gjalla.
Një rrëshqitës mbulesë 25 mm në diametër dhe 150 µm i trashë i veshur me nanogrimca ari u vendos në një dhomë AttofluorTM (Thermofisher) me nanogrimcat e arit të kthyera nga lart. Geobacillus stearothermophilus u parakulturua gjatë natës në mjedis LB (200 rpm, 60°C) përpara çdo dite eksperimenti. Një pikë prej 5 µl e një suspensioni të G. stearothermophilus me një densitet optik (OD) prej 0.3 deri në 0.5 u vendos në një mbulesë me nanogrimca ari. Më pas, një kapak i rrumbullakët me diametër 18 mm me një vrimë me diametër 5 mm në qendër u hodh mbi pikën dhe 5 μl suspension bakterial me të njëjtën densitet optik u aplikua në mënyrë të përsëritur në qendër të vrimës. Puset në mbulesa janë përgatitur në përputhje me procedurën e përshkruar në ref. 45 (shih Informacioni Suplementar për më shumë informacion). Më pas shtoni 1 ml medium LB në kapak për të parandaluar tharjen e shtresës së lëngshme. Kapaku i fundit vendoset mbi kapakun e mbyllur të dhomës Attofluor™ për të parandaluar avullimin e mediumit gjatë inkubacionit. Për eksperimentet e mbirjes, ne përdorëm spore, të cilat, pas eksperimenteve konvencionale, ndonjëherë mbulonin mbulesën e sipërme. Një metodë e ngjashme u përdor për të marrë Sulfolobus shibatae. Tre ditë (200 rpm, 75°C) të kultivimit paraprak të Thiobacillus serrata u kryen në mjedisin 182 (DSMZ).
Mostrat e nanogrimcave të arit u përgatitën me anë të litografisë së kopolimerit me bllok micellar. Ky proces përshkruhet në detaje në kapitullin. 60. Shkurtimisht, micelat që kapsulojnë jonet e arit u sintetizuan duke përzier kopolimerin me HAuCl4 në toluen. Mbulesat e pastruara më pas u zhytën në tretësirë ​​dhe u trajtuan me rrezatim UV në prani të një agjenti reduktues për të marrë farat e arit. Më në fund, farat e arit u rritën duke kontaktuar një mbulesë me një tretësirë ​​ujore të KAuCl4 dhe etanolaminës për 16 minuta, gjë që rezultoi në një rregullim thuajse periodik dhe shumë uniform të nanogrimcave të arit jo sferike në infra të kuqe të afërt.
Për të kthyer interferogramet në imazhe OT, ne përdorëm një algoritëm shtëpiak, siç detajohet në lidhje. 33 dhe është i disponueshëm si një paketë Matlab në depon e mëposhtme publike: https://github.com/baffou/CGMprocess. Paketa mund të llogarisë intensitetin dhe imazhet OT bazuar në interferogramet e regjistruara (përfshirë imazhet e referencës) dhe distancat e grupit të kamerës.
Për të llogaritur modelin fazor të aplikuar në SLM për të marrë një profil të caktuar të temperaturës, ne përdorëm një algoritëm të zhvilluar më parë të bërë në shtëpi39,42 i cili është i disponueshëm në depon e mëposhtme publike: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Hyrja është fusha e dëshiruar e temperaturës, e cila mund të vendoset në mënyrë dixhitale ose nëpërmjet një imazhi bmp monokrom.
Për të segmentuar qelizat dhe për të matur peshën e tyre të thatë, ne përdorëm algoritmin tonë Matlab të publikuar në depon e mëposhtme publike: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Në çdo imazh, përdoruesi duhet të klikojë mbi bakteret ose mCFU me interes, të rregullojë ndjeshmërinë e shkopit dhe të konfirmojë përzgjedhjen.
Për më shumë informacion mbi hartimin e studimit, shihni abstraktin e Raportit të Kërkimit të Natyrës të lidhur me këtë artikull.
Të dhënat që mbështesin rezultatet e këtij studimi janë në dispozicion nga autorët përkatës me kërkesë të arsyeshme.
Kodi burimor i përdorur në këtë studim është i detajuar në seksionin Metodat dhe versionet e korrigjimit mund të shkarkohen nga https://github.com/baffou/ në depot e mëposhtme: SLM_temperatureShaping, CGMprocess dhe CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight into thermophiles dhe aplikimet e tyre me spektër të gjerë. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight into thermophiles dhe aplikimet e tyre me spektër të gjerë.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. dhe Sharma, AK Përmbledhje e termofileve dhe aplikimi i tyre i gjerë. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. dhe Sharma AK Një kuptim i thellë i termofilëve dhe një gamë të gjerë aplikimesh.3 Bioteknologjia 6, 81 (2016).