Sëmundjes së Alzheimerit (AD) i mungojnë biomarkerët e proteinave që pasqyrojnë patofiziologjinë e saj themelore, duke penguar përparimin e diagnozës dhe trajtimit. Këtu, ne përdorim proteomikë gjithëpërfshirëse për të identifikuar biomarkerët e lëngut cerebrospinal (CSF) që përfaqësojnë një gamë të gjerë të patofiziologjisë së AD. Spektrometria e masës multipleks identifikoi afërsisht 3500 dhe afërsisht 12000 proteina në AD CSF dhe tru, përkatësisht. Analiza e rrjetit të proteomës së trurit zgjidhi 44 module të biodiversitetit, 15 prej të cilave mbivendosen me proteomën e lëngut cerebrospinal. Markuesit AD CSF në këto module të mbivendosura janë palosur në pesë grupe proteinash, që përfaqësojnë procese të ndryshme patofiziologjike. Sinapsat dhe metabolitët në trurin e AD zvogëlohen, por CSF rritet, ndërsa mielinimi i pasur me gliale dhe grupet imune në tru dhe CSF rriten. Konsistenca dhe specifika e sëmundjes e ndryshimeve të panelit u konfirmuan në më shumë se 500 mostra shtesë të CSF. Këto grupe identifikuan gjithashtu nëngrupe biologjike në AD asimptomatike. Në përgjithësi, këto rezultate janë një hap premtues drejt mjeteve të biomarkerëve të bazuara në ueb për aplikimet klinike në AD.
Sëmundja e Alzheimerit (AD) është shkaku më i zakonshëm i demencës neurodegjenerative në mbarë botën dhe karakterizohet nga një gamë e gjerë mosfunksionimesh të sistemit biologjik, duke përfshirë transmetimin sinaptik, imunitetin e ndërmjetësuar nga glia dhe metabolizmin mitokondrial (1-3). Megjithatë, biomarkerët e saj të themeluar të proteinave ende fokusohen në zbulimin e proteinës amiloide dhe tau, dhe për këtë arsye nuk mund të pasqyrojnë këtë patofiziologji të ndryshme. Këta biomarkues proteinash “bërthamë” që maten në mënyrë më të besueshme në lëngun cerebrospinal (CSF) përfshijnë (i) peptidin beta amiloid 1-42 (Aβ1-42), i cili pasqyron formimin e pllakave amiloide kortikale; (ii) tau totale, një shenjë e degjenerimit të aksonit; (iii) fosfo-tau (p-tau), një përfaqësues i hiperfosforilimit patologjik tau (4-7). Megjithëse këta biomarkues të lëngut cerebrospinal kanë lehtësuar shumë zbulimin tonë të sëmundjeve të proteinave AD "të shënuara" (4-7), ata përfaqësojnë vetëm një pjesë të vogël të biologjisë komplekse që qëndron pas sëmundjes.
Mungesa e diversitetit patofiziologjik të biomarkerëve të AD ka çuar në shumë sfida, duke përfshirë (i) paaftësinë për të identifikuar dhe përcaktuar sasinë e heterogjenitetit biologjik të pacientëve me AD, (ii) matje të pamjaftueshme të ashpërsisë dhe përparimit të sëmundjes, veçanërisht në fazën paraklinike, dhe iii) zhvillimi i barnave terapeutike që nuk arritën të zgjidhin plotësisht të gjitha aspektet e përkeqësimit neurologjik. Mbështetja jonë në patologjinë historike për të përshkruar AD nga sëmundjet e lidhura vetëm sa i përkeqëson këto probleme. Gjithnjë e më shumë prova tregojnë se shumica e të moshuarve me demencë kanë më shumë se një karakteristikë patologjike të rënies njohëse (8). Rreth 90% ose më shumë e individëve me patologji të AD gjithashtu kanë sëmundje vaskulare, përfshirje TDP-43 ose sëmundje të tjera degjenerative (9). Këto përmasa të larta të mbivendosjes patologjike kanë prishur kuadrin tonë aktual diagnostik për demencën dhe nevojitet një përkufizim patofiziologjik më gjithëpërfshirës i sëmundjes.
Duke pasur parasysh nevojën urgjente për një shumëllojshmëri biomarkerësh AD, fusha po adopton gjithnjë e më shumë metodën "omics" bazuar në sistemin e përgjithshëm për zbulimin e biomarkerëve. Aleanca e Përshpejtuar e Partneritetit Farmaceutik (AMP)-AD u lançua në vitin 2014 dhe është në ballë të programit. Kjo përpjekje shumëdisiplinore nga Instituti Kombëtar i Shëndetit, akademia dhe industria synon të përdorë strategji të bazuara në sistem për të përcaktuar më mirë patofiziologjinë e AD dhe për të zhvilluar analiza diagnostikuese të biodiversitetit dhe strategji trajtimi (10). Si pjesë e këtij projekti, proteomika e rrjetit është bërë një mjet premtues për avancimin e biomarkerëve të bazuar në sistem në AD. Kjo qasje e paanshme e drejtuar nga të dhënat organizon grupe komplekse të të dhënave proteomike në grupe ose "module" të proteinave të bashkë-shprehura që lidhen me lloje specifike qelizash, organele dhe funksione biologjike (11-13). Pothuajse 12 studime proteomike të rrjetit të pasura me informacion janë kryer në trurin e AD (13-23). Në përgjithësi, këto analiza tregojnë se proteoma e rrjetit të trurit AD mban një organizim modular shumë të konservuar në grupe të pavarura dhe rajone të shumta kortikale. Përveç kësaj, disa nga këto module tregojnë ndryshime të riprodhueshme në bollëkun e lidhur me AD në grupet e të dhënave, duke reflektuar patofiziologjinë e sëmundjeve të shumta. Së bashku, këto gjetje demonstrojnë një pikë ankorimi premtuese për zbulimin e proteomës së rrjetit të trurit si një biomarker i bazuar në sistem në AD.
Për të transformuar proteomën e rrjetit të trurit AD në biomarkues të dobishëm klinikisht të bazuar në sistem, ne kombinuam rrjetin e rrjedhur nga truri me analizën proteomike të AD CSF. Kjo qasje e integruar çoi në identifikimin e pesë grupeve premtuese të biomarkerëve CSF që lidhen me një gamë të gjerë patofiziologjie të bazuar në tru, duke përfshirë sinapset, enët e gjakut, mielinimin, inflamacionin dhe mosfunksionimin e rrugëve metabolike. Ne i vërtetuam me sukses këto panele biomarkerësh përmes analizave të shumëfishta të riprodhimit, duke përfshirë më shumë se 500 mostra CSF nga sëmundje të ndryshme neurodegjenerative. Këto analiza të vërtetimit përfshijnë ekzaminimin e objektivave të grupit në CSF të pacientëve me AD asimptomatike (AsymAD) ose shfaqjen e dëshmive të akumulimit jonormal të amiloidit në një mjedis normal kognitiv. Këto analiza nxjerrin në pah heterogjenitetin e rëndësishëm biologjik në popullatën AsymAD dhe identifikojnë shënuesit e panelit që mund të jenë në gjendje të nëntipojnë individët në fazat më të hershme të sëmundjes. Në përgjithësi, këto rezultate përfaqësojnë një hap kyç në zhvillimin e mjeteve të biomarkerëve të proteinave të bazuara në sisteme të shumta që mund të zgjidhin me sukses shumë nga sfidat klinike me të cilat përballet AD.
Qëllimi kryesor i këtij studimi është identifikimi i biomarkerëve të rinj të lëngut cerebrospinal që pasqyrojnë patofiziologji të ndryshme të bazuara në tru që çojnë në AD. Figura S1 përshkruan metodologjinë tonë të kërkimit, e cila përfshin (i) një analizë gjithëpërfshirëse të drejtuar nga gjetjet paraprake të AD CSF dhe proteomës së trurit të rrjetit për të identifikuar biomarkerët e shumtë të sëmundjes CSF të lidhura me trurin, dhe (ii) replikimin e mëvonshëm Këta bioshënues janë në disa cerebrospinal të pavarur grupe fluide. Hulumtimi i orientuar drejt zbulimit filloi me analizën e shprehjes diferenciale të CSF në 20 individë normalë njohës dhe 20 pacientë të AD në Qendrën Kërkimore të Sëmundjeve Alzheimer Emory Goizueta (ADRC). Diagnoza e AD përkufizohet si një dëmtim i rëndësishëm njohës në prani të Aβ1-42 të ulët dhe nivele të ngritura të totalit tau dhe p-tau në lëngun cerebrospinal [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA )]] (Tabela S1A). Kontrolli (mesatarja e MCA, 26,7 ± 2,2) kishte nivele normale të biomarkerëve CSF.
CSF e njeriut karakterizohet nga një gamë dinamike e bollëkut të proteinave, në të cilën albumina dhe proteinat e tjera jashtëzakonisht të bollshme mund të parandalojnë zbulimin e proteinave me interes (24). Për të rritur thellësinë e zbulimit të proteinave, ne hoqëm 14 proteinat e para shumë të bollshme nga çdo mostër CSF përpara analizës së spektrometrisë së masës (MS) (24). Gjithsej 39,805 peptide u identifikuan nga MS, të cilat u ndanë në 3691 proteome në 40 mostra. Përcaktimi i sasisë së proteinave kryhet me etiketim të shumëfishtë në masë (TMT) (18, 25). Për të zgjidhur të dhënat që mungojnë, ne përfshimë vetëm ato proteina që u përcaktuan në sasi në të paktën 50% të mostrave në analizën pasuese, duke përcaktuar kështu përfundimisht 2875 proteome. Për shkak të ndryshimit të rëndësishëm në nivelet e bollëkut total të proteinave, një kampion kontrolli u konsiderua statistikisht si një i jashtëm (13) dhe nuk u përfshi në analizën pasuese. Vlerat e bollëkut të 39 mostrave të mbetura u rregulluan sipas moshës, gjinisë dhe bashkëvariancës së grupit (13-15, 17, 18, 20, 26).
Duke përdorur analizën statistikore t-test për të vlerësuar shprehjen diferenciale në grupin e të dhënave të regresionit, kjo analizë identifikoi proteinat nivelet e bollëkut të të cilave u ndryshuan ndjeshëm (P <0.05) midis rasteve të kontrollit dhe AD (Tabela S2A). Siç tregohet në figurën 1A, bollëku i gjithsej 225 proteinave në AD u reduktua ndjeshëm, dhe bollëku i 303 proteinave u rrit ndjeshëm. Këto proteina të shprehura në mënyrë diferenciale përfshijnë disa shënues AD të lëngut cerebrospinal të identifikuar më parë, të tillë si proteina tau e lidhur me mikrotubulat (MAPT; P = 3,52 × 10−8), neurofilament (NEFL; P = 6,56 × 10−3), proteina e lidhur me rritjen 43 (GAP43; P = 1,46 × 10−5), Proteina lidhëse me acide yndyrore 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), Kitinaza 3 si 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), Granulin Neural (NRGN; P = 3,43 × 10−4) dhe faktori i rritjes nervore VGF (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Megjithatë, ne identifikuam gjithashtu objektiva të tjerë shumë të rëndësishëm, si frenuesi i disociimit të GDP 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) dhe lidhja modulare e kalciumit 1 e lidhur me SPARC (SMOC1; P = 6.93 × 10-9). Analiza e Ontologjisë Gjenetike (GO) e 225 proteinave të reduktuara në mënyrë të konsiderueshme zbuloi lidhje të ngushta me proceset e lëngjeve të trupit si metabolizmi i steroideve, koagulimi i gjakut dhe aktiviteti i hormoneve (Figura 1B dhe Tabela S2B). Në të kundërt, proteina e rritur ndjeshëm e 303 është e lidhur ngushtë me strukturën e qelizave dhe metabolizmin e energjisë.
(A) Grafiku i vullkanit tregon ndryshimin e palosjes log2 (boshti x) në lidhje me vlerën statistikore P -log10 (boshti y) të marrë nga testi t, i cili përdoret për të zbuluar shprehjen diferenciale midis kontrollit (CT) dhe kontrollit (CT) dhe Rastet e AD të proteomës CSF Nga të gjitha proteinat. Proteinat me nivele të reduktuara ndjeshëm (P <0.05) në AD tregohen me blu, ndërsa proteinat me nivele të rritura ndjeshëm në sëmundje tregohen me të kuqe. Proteina e përzgjedhur është etiketuar. (B) Termat kryesorë të GO në lidhje me proteinën janë reduktuar ndjeshëm (blu) dhe janë rritur (e kuqe) në AD. Tregon tre termat GO me rezultatet më të larta z në fushat e proceseve biologjike, funksioneve molekulare dhe komponentëve qelizorë. (C) MS mati nivelin MAPT në kampionin CSF (majtas) dhe korrelacionin e tij me nivelin tau të mostrës ELISA (djathtas). Shfaqet koeficienti i korrelacionit Pearson me vlerën përkatëse P. Për shkak të mungesës së të dhënave ELISA për një rast AD, këto shifra përfshijnë vlerat për 38 nga 39 rastet e analizuara. (D) Analiza e grupeve të mbikëqyrura (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) P <0.01 e rregulluar) në kontrollin dhe AD CSF gjeti mostra duke përdorur 65 proteinat më të ndryshuara në grupin e të dhënave. Standardizo, normalizo.
Niveli proteomik i MAPT është i lidhur ngushtë me nivelin tau ELISA të matur në mënyrë të pavarur (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; Figura 1C), duke mbështetur vlefshmërinë e matjes sonë MS. Pas tretjes së tripsinës në nivelin e proteinës pararendëse të amiloidit (APP), peptidet specifike të izoformës të përcaktuara në fundin C të Aβ1-40 dhe Aβ1-42 nuk mund të jonizohen në mënyrë efikase (27, 28). Prandaj, peptidet APP që identifikuam nuk kanë asnjë lidhje me nivelet ELISA Aβ1-42. Për të vlerësuar shprehjen diferenciale të secilit rast, ne përdorëm proteina të shprehura në mënyrë diferenciale me P <0.0001 [shkalla e zbulimit të rremë (FDR) e korrigjuar P <0.01] për të kryer një analizë grupi të mbikëqyrur të mostrave (Tabela S2A). Siç tregohet në figurën 1D, këto 65 proteina shumë të rëndësishme mund të grumbullojnë saktë mostrat sipas gjendjes së sëmundjes, me përjashtim të një rasti AD me karakteristika të ngjashme me kontrollin. Nga këto 65 proteina, 63 u rritën në AD, ndërsa vetëm dy (CD74 dhe ISLR) u ulën. Në total, këto analiza të lëngut cerebrospinal kanë identifikuar qindra proteina në AD që mund të shërbejnë si biomarkera të sëmundjes.
Pastaj ne kryem një analizë të pavarur të rrjetit të proteomës së trurit AD. Grupi i trurit të këtij zbulimi përfshinte korteksin paraballor dorsolateral (DLPFC) nga rastet e kontrollit (n = 10), sëmundjen e Parkinsonit (PD; n = 10), AD/PD të përzier (n = 10) dhe AD (n = 10). ) Mostra. Emery Goizueta ADRC. Demografia e këtyre 40 rasteve është përshkruar më parë (25) dhe është përmbledhur në tabelën S1B. Ne përdorëm TMT-MS për të analizuar këto 40 inde të trurit dhe grupin e replikimit të 27 rasteve. Në total, këto dy grupe të të dhënave të trurit prodhuan 227,121 peptide unike, të cilat u hartuan në 12,943 proteome (25). Vetëm ato proteina që u përcaktuan në sasi në të paktën 50% të rasteve u përfshinë në hetimet e mëvonshme. Grupi përfundimtar i të dhënave të zbulimit përmban 8817 proteina të kuantifikuara. Rregulloni nivelet e bollëkut të proteinave bazuar në moshën, gjininë dhe intervalin pas vdekjes (PMI). Analiza e shprehjes diferenciale e grupit të të dhënave pas regresionit tregoi se nivelet e proteinave >2000 ndryshuan ndjeshëm [P <0.05, analiza e variancës (ANOVA)] në dy ose më shumë grupe sëmundjesh. Më pas, ne kryem një analizë grupimi të mbikëqyrur bazuar në proteinat e shprehura në mënyrë diferenciale, dhe P <0.0001 në krahasimet AD/kontroll dhe/ose AD/PD (Figura S2, A dhe B, Tabela S2C). Këto 165 proteina shumë të ndryshuara përshkruajnë qartë rastet me patologji AD nga mostrat e kontrollit dhe PD, duke konfirmuar ndryshimet e forta specifike të AD në të gjithë proteomën.
Më pas përdorëm një algoritëm të quajtur Analiza e rrjetit të bashkë-shprehjes së gjeneve të peshuara (WGCNA) për të kryer analizën e rrjetit në proteomën e zbuluar të trurit, e cila organizon grupin e të dhënave në module proteinash me modele të ngjashme shprehjeje (11-13). Analiza identifikoi 44 module (M) proteina të bashkë-shprehura, të renditura dhe të numëruara nga më e madhja (M1, n = 1821 proteina) tek më e vogla (M44, n = 34 proteina) (Figura 2A dhe Tabela S2D) ). Siç u përmend më lart (13) Llogaritni profilin përfaqësues të shprehjes ose proteinën karakteristike të secilit modul dhe lidhni atë me gjendjen e sëmundjes dhe patologjinë e AD, domethënë, vendosni aleancën e Regjistrit të Sëmundjeve të Alzheimerit (CERAD) dhe Braak Score (Figura 2B). Në përgjithësi, 17 module ishin të lidhura ndjeshëm me neuropatologjinë e AD (P <0.05). Shumë prej këtyre moduleve të lidhura me sëmundjen janë gjithashtu të pasura me shënues specifikë të tipit qelizor (Figura 2B). Siç u përmend më lart (13), pasurimi i tipit qelizor përcaktohet duke analizuar mbivendosjen e modulit dhe listën e referencës së gjeneve specifike të tipit qelizor. Këto gjene rrjedhin nga të dhënat e publikuara në neuronet e izoluara të miut, qelizat endoteliale dhe gliale. Eksperimenti i sekuencës së ARN-së (ARN-seq) (29).
(A) Zbuloni WGCNA të proteomës së trurit. (B) Analiza e ndërmjetme me peshë (BiCor) e proteinës së nënshkrimit modular (përbërësi i parë kryesor i shprehjes së proteinave modulare) me karakteristika neuropatologjike të AD (lart), duke përfshirë rezultatet CERAD (pllakë Aβ) dhe Braak (tau tangles). Intensiteti i korrelacioneve pozitive (e kuqe) dhe negative (blu) tregohen nga një hartë e nxehtësisë me dy ngjyra, dhe yjet tregojnë rëndësinë statistikore (P <0.05). Përdorni Testin e saktë të Fisher Hypergeometric (FET) (poshtë) për të vlerësuar lidhjen e tipit qelizor të secilit modul proteinik. Intensiteti i hijes së kuqe tregon shkallën e pasurimit të tipit qelizor, dhe ylli tregon rëndësinë statistikore (P <0,05). Përdorni metodën BH për të korrigjuar vlerën P që rrjedh nga FET. (C) Analiza GO e proteinave modulare. Proceset biologjike më të lidhura ngushtë janë paraqitur për secilin modul ose grup modulesh përkatëse. oligo, oligodendrocit.
Një grup prej pesë modulesh të pasura me astrocite dhe mikroglia të lidhura ngushtë (M30, M29, M18, M24 dhe M5) treguan një korrelacion të fortë pozitiv me neuropatologjinë AD (Figura 2B). Analiza ontologjike i lidh këto module gliale me rritjen, përhapjen dhe imunitetin e qelizave (Figura 2C dhe Tabela S2E). Dy module shtesë gliale, M8 dhe M22, janë gjithashtu të rregulluara fuqishëm në sëmundje. M8 është shumë i lidhur me rrugën e receptorit të ngjashëm me Toll, një kaskadë sinjalizuese që luan një rol kyç në përgjigjen imune të lindur (30). Në të njëjtën kohë, M22 është i lidhur ngushtë me modifikimin pas përkthimit. M2, i cili është i pasur me oligodendrocite, tregon një korrelacion të fortë pozitiv me patologjinë e AD dhe një lidhje ontologjike me sintezën e nukleozideve dhe replikimin e ADN-së, duke treguar rritjen e përhapjes së qelizave në sëmundje. Në përgjithësi, këto gjetje mbështesin ngritjen e moduleve gliale që kemi vërejtur më parë në proteomën e rrjetit AD (13, 17). Aktualisht është gjetur se shumë module gliale të lidhura me AD në rrjet tregojnë nivele më të ulëta të shprehjes në rastet e kontrollit dhe PD, duke theksuar specifikën e tyre të sëmundjes që është e ngritur në AD (Figura S2C).
Vetëm katër module në proteomën e rrjetit tonë (M1, M3, M10 dhe M32) janë të lidhura fuqishëm negativisht me patologjinë e AD (P <0.05) (Figura 2, B dhe C). Të dy M1 dhe M3 janë të pasur me shënues neuronalë. M1 është shumë i lidhur me sinjalet sinaptike, ndërsa M3 është i lidhur ngushtë me funksionin mitokondrial. Nuk ka asnjë dëshmi të pasurimit të tipit qelizor për M10 dhe M32. M32 pasqyron lidhjen midis M3 dhe metabolizmit qelizor, ndërsa M10 është shumë i lidhur me rritjen e qelizave dhe funksionin e mikrotubulave. Krahasuar me AD, të katër modulet janë rritur në kontroll dhe PD, duke u dhënë atyre ndryshime AD specifike për sëmundje (Figura S2C). Në përgjithësi, këto rezultate mbështesin zvogëlimin e bollëkut të moduleve të pasura me neurone që kemi vërejtur më parë në AD (13, 17). Në përmbledhje, analiza e rrjetit të proteomës së trurit që zbuluam prodhoi module të ndryshuara në mënyrë specifike në përputhje me gjetjet tona të mëparshme.
AD karakterizohet nga një fazë e hershme asimptomatike (AsymAD), në të cilën individët shfaqin akumulim amiloide pa rënie klinike njohëse (5, 31). Kjo fazë asimptomatike përfaqëson një dritare kritike për zbulimin dhe ndërhyrjen e hershme. Ne kemi demonstruar më parë një ruajtje të fortë modulare të proteomës së rrjetit të trurit AsymAD dhe AD në grupe të pavarura të dhënash (13, 17). Për të siguruar që rrjeti i trurit që kemi zbuluar aktualisht është në përputhje me këto gjetje të mëparshme, ne analizuam ruajtjen e 44 moduleve në grupin e të dhënave të përsëritura nga 27 organizata DLPFC. Këto organizata përfshijnë raste të kontrollit (n = 10), AsymAD (n = 8 ) dhe AD (n = 9). Mostrat e kontrollit dhe AD u përfshinë në analizën e grupit tonë të trurit të zbulimit (Tabela S1B), ndërsa rastet e AsymAD ishin unike vetëm në grupin e përsëritjes. Këto raste AsymAD erdhën gjithashtu nga banka e trurit Emory Goizueta ADRC. Megjithëse njohja ishte normale në momentin e vdekjes, nivelet e amiloidit ishin anormalisht të larta (mesatarja CERAD, 2,8 ± 0,5) (Tabela S1B).
Analiza TMT-MS e këtyre 27 indeve të trurit rezultoi në përcaktimin sasior të 11,244 proteomeve. Ky numërim përfundimtar përfshin vetëm ato proteina të përcaktuara në sasi në të paktën 50% të mostrave. Ky grup i të dhënave të përsëritura përmban 8638 (98.0%) nga 8817 proteinat e zbuluara në analizën tonë të trurit të zbulimit dhe ka gati 3000 proteina të ndryshuara ndjeshëm midis grupeve të kontrollit dhe AD (P <0.05, pas testit t çift të Tukey për analizën e variancës) ( Tabela S2F). Midis këtyre proteinave të shprehura në mënyrë diferenciale, 910 treguan gjithashtu ndryshime të rëndësishme të nivelit midis rasteve të kontrollit të AD dhe proteomës së trurit (P <0.05, pas T-testit të çiftëzuar ANOVA Tukey). Vlen të përmendet se këta 910 shënues janë shumë të qëndrueshëm në drejtimin e ndryshimit midis proteomeve (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (Figura S3A). Ndër proteinat e rritura, proteinat me ndryshimet më të qëndrueshme midis grupeve të të dhënave janë kryesisht anëtarë të moduleve M5 dhe M18 të pasura me gliale (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 dhe GFAP). Ndër proteinat e reduktuara, ato me ndryshimet më të qëndrueshme ishin pothuajse ekskluzivisht anëtarë të modulit M1 (NPTX2, VGF dhe RPH3A) të lidhur me sinapsin. Ne verifikuam më tej ndryshimet e lidhura me AD të midkine (MDK), CD44, proteina 1 (SFRP1) dhe VGF e sekretuar nga western blotting (Figura S3B). Analiza e ruajtjes së modulit tregoi se rreth 80% e moduleve proteinike (34/44) në proteomën e trurit u ruajtën ndjeshëm në grupin e të dhënave të replikimit (z-rezultati> 1,96, FDR i korrigjuar P <0,05) (Figura S3C). Katërmbëdhjetë nga këto module u rezervuan posaçërisht midis dy proteomeve (z-rezultati> 10, FDR i korrigjuar P <1.0 × 10−23). Në përgjithësi, zbulimi dhe përsëritja e shkallës së lartë të konsistencës në shprehjen diferenciale dhe përbërjen modulare midis proteomës së trurit nxjerr në pah riprodhueshmërinë e ndryshimeve në proteinat e korteksit ballor AD. Përveç kësaj, ai gjithashtu konfirmoi se AsymAD dhe sëmundjet më të avancuara kanë një strukturë shumë të ngjashme të rrjetit të trurit.
Një analizë më e detajuar e shprehjes diferenciale në grupin e të dhënave të riprodhimit të trurit nxjerr në pah shkallën e rëndësishme të ndryshimeve të proteinës AsymAD, duke përfshirë një total prej 151 proteinash të ndryshuara dukshëm midis AsymAD dhe kontrollit (P <0.05) (Figura S3D). Në përputhje me ngarkesën e amiloidit, APP në trurin e AsymAD dhe AD u rrit ndjeshëm. MAPT ndryshon ndjeshëm vetëm në AD, e cila është në përputhje me nivelet e rritura të ngatërresave dhe korrelacionin e njohur të tij me rënien njohëse (5, 7). Modulet e pasura me gliale (M5 dhe M18) reflektohen shumë në rritjen e proteinave në AsymAD, ndërsa moduli M1 i lidhur me neuronet është më përfaqësuesi i proteinave të reduktuara në AsymAD. Shumë nga këta shënues AsymAD tregojnë ndryshime më të mëdha në sëmundjet simptomatike. Midis këtyre shënuesve është SMOC1, një proteinë gliale që i përket M18, e cila lidhet me tumoret e trurit dhe zhvillimin e syve dhe gjymtyrëve (32). MDK është një faktor i rritjes që lidh heparinën që lidhet me rritjen e qelizave dhe angiogjenezën (33), një tjetër anëtar i M18. Krahasuar me grupin e kontrollit, AsymAD u rrit ndjeshëm, e ndjekur nga një rritje më e madhe e AD. Në të kundërt, proteina sinaptike neuropentraksina 2 (NPTX2) u reduktua ndjeshëm në trurin AsymAD. NPTX2 ishte i lidhur më parë me neurodegjenerimin dhe ka një rol të njohur në ndërmjetësimin e sinapseve ngacmuese (34). Në përgjithësi, këto rezultate zbulojnë një sërë ndryshimesh të ndryshme të proteinave paraklinike në AD që duket se përparojnë me ashpërsinë e sëmundjes.
Duke qenë se kemi arritur një thellësi të konsiderueshme të mbulimit të proteinave në zbulimin e proteomës së trurit, ne po përpiqemi të kuptojmë më plotësisht mbivendosjen e tij me transkriptomën AD në nivel rrjeti. Prandaj, ne krahasuam proteomën e trurit që zbuluam me modulin që krijuam më parë nga matja e mikrovargut të 18,204 gjeneve në AD (n = 308) dhe kontroll (n = 157) indet DLPFC (13). mbivendosje. Në total, ne identifikuam 20 module të ndryshme të ARN-së, shumë prej të cilave demonstruan pasurimin e llojeve specifike të qelizave, duke përfshirë neuronet, oligodendrocitet, astrocitet dhe mikroglia (Figura 3A). Ndryshimet e shumta të këtyre moduleve në AD janë paraqitur në Figurën 3B. Në përputhje me analizën tonë të mëparshme të mbivendosjes së proteinave-ARN duke përdorur proteomën më të thellë të paetiketuar MS (rreth 3000 proteina) (13), shumica e 44 moduleve në rrjetin e proteomeve të trurit që gjetëm janë në rrjetin e transkriptomës Nuk ka mbivendosje të rëndësishme. Edhe në Zbulimi dhe riprodhimi ynë i 34 moduleve proteinike që mbahen shumë në proteomën e trurit, vetëm 14 (~ 40%) kaluan testin e saktë të Fisher (FET) rezultoi se kishte një mbivendosje statistikisht domethënëse me transkriptomën (Figura 3A). E pajtueshme me riparimin e dëmtimit të ADN-së (P-M25 dhe P-M19), përkthimin e proteinave (P-M7 dhe P-M20), lidhjen/bashkimin e ARN-së (P-M16 dhe P-M21) dhe shënjestrimin e proteinave (P-M13 dhe P- M23) nuk mbivendoset me modulet në transkriptomë. Prandaj, megjithëse një grup i të dhënave më të thellë të proteomeve përdoret në analizën aktuale të mbivendosjes (13), shumica e proteomës së rrjetit AD nuk është hartuar në rrjetin e transkriptomës.
(A) FET hipergjeometrik demonstron pasurimin e shënuesve specifikë të tipit qelizor në modulin e ARN-së të transkriptomës AD (lart) dhe shkallën e mbivendosjes midis moduleve të ARN-së (boshti x) dhe proteinës (boshti y) të trurit AD (poshtë). Intensiteti i hijes së kuqe tregon shkallën e pasurimit të llojeve të qelizave në panelin e sipërm dhe intensitetin e mbivendosjes së moduleve në panelin e poshtëm. Yjet tregojnë rëndësinë statistikore (P <0,05). (B) Shkalla e korrelacionit midis gjeneve karakteristike të secilit modul të transkriptomit dhe statusit të AD. Modulet në të majtë janë më të lidhura negativisht me AD (blu), dhe ato në të djathtë janë më pozitivisht të lidhura me AD (e kuqe). Vlera P e korrigjuar nga BH e transformuar në log tregon shkallën e rëndësisë statistikore të çdo korrelacioni. (C) Module të mbivendosura të rëndësishme me pasurim të tipit të përbashkët të qelizave. (D) Analiza e korrelacionit të ndryshimit log2 të palosjes së proteinës së etiketuar (boshti x) dhe ARN (boshti y) në modulin e mbivendosur. Shfaqet koeficienti i korrelacionit Pearson me vlerën përkatëse P. Mikro, mikroglia; trupat qiellorë, astrocitet. CT, kontroll.
Shumica e moduleve të mbivendosura të proteinave dhe ARN-së ndajnë profile të ngjashme pasurimi të tipit qelizor dhe drejtime të qëndrueshme të ndryshimit të AD (Figura 3, B dhe C). Me fjalë të tjera, moduli M1 i lidhur me sinapsin i proteomës së trurit (PM1) është hartuar në tre module ARN homologe të pasura me neurone (R-M1, R-M9 dhe R-M16), të cilat janë në AD Të dyja treguan një nivel të reduktuar. Në mënyrë të ngjashme, modulet e proteinave M5 dhe M18 të pasura me gliale mbivendosen me modulet e ARN-së të pasura me astrocite dhe shënues mikroglial (R-M3, R-M7 dhe R-M10) dhe janë shumë të përfshirë në rritjen e sëmundjeve. Këto veçori të përbashkëta modulare midis dy grupeve të të dhënave mbështesin më tej pasurimin e llojit të qelizave dhe ndryshimet që lidhen me sëmundjen që kemi vërejtur në proteomën e trurit. Sidoqoftë, ne vëzhguam shumë dallime domethënëse midis niveleve të ARN-së dhe proteinave të shënuesve individualë në këto module të përbashkëta. Analiza e korrelacionit të shprehjes diferenciale të proteomikës dhe transkriptomikës së molekulave brenda këtyre moduleve të mbivendosura (Figura 3D) nxjerr në pah këtë mospërputhje. Për shembull, APP dhe disa proteina të tjera të modulit glial (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 dhe SFRP1) treguan një rritje të konsiderueshme në proteomën AD, por nuk kishte pothuajse asnjë ndryshim në transkriptomën AD. Këto ndryshime specifike të proteinave mund të jenë të lidhura ngushtë me pllakat amiloide (23, 35), duke theksuar proteomën si burimin e ndryshimeve patologjike dhe këto ndryshime mund të mos reflektohen në transkriptomë.
Pas analizimit të pavarur të proteomeve të trurit dhe CSF që zbuluam, ne kryem një analizë gjithëpërfshirëse të dy grupeve të të dhënave për të identifikuar biomarkerët AD CSF që lidhen me patofiziologjinë e rrjetit të trurit. Së pari duhet të përcaktojmë mbivendosjen e dy proteomeve. Megjithëse pranohet gjerësisht se CSF reflekton ndryshime neurokimike në trurin AD (4), shkalla e saktë e mbivendosjes midis trurit AD dhe proteomës CSF është e paqartë. Duke krahasuar numrin e produkteve të përbashkëta të gjenit të zbuluar në dy proteomet tona, ne zbuluam se gati 70% (n = 1936) e proteinave të identifikuara në lëngun cerebrospinal u përcaktuan gjithashtu në tru (Figura 4A). Shumica e këtyre proteinave të mbivendosura (n = 1721) janë hartuar në një nga 44 modulet e bashkë-shprehjes nga grupi i të dhënave të trurit të zbulimit (Figura 4B). Siç pritej, gjashtë modulet më të mëdha të trurit (M1 në M6) shfaqën sasinë më të madhe të mbivendosjes CSF. Megjithatë, ka module më të vogla të trurit (për shembull, M15 dhe M29) që arrijnë një shkallë të papritur të lartë mbivendosjeje, më të madhe se një modul truri dyfishi i madhësisë së tij. Kjo na motivon të adoptojmë një metodë më të detajuar, të drejtuar statistikisht për të llogaritur mbivendosjen midis trurit dhe lëngut cerebrospinal.
(A dhe B) Proteinat e zbuluara në grupet e të dhënave të trurit të zbulimit dhe CSF mbivendosen. Shumica e këtyre proteinave të mbivendosura janë të lidhura me një nga 44 modulet e bashkë-shprehjes së rrjetit të bashkë-shprehjes së trurit. (C) Zbuloni mbivendosjen midis proteomës së lëngut cerebrospinal dhe proteomës së rrjetit të trurit. Çdo rresht i hartës së nxehtësisë përfaqëson një analizë të veçantë mbivendosjeje të FET hipergjeometrik. Rreshti i sipërm përshkruan mbivendosjen (hije gri/e zezë) midis modulit të trurit dhe të gjithë proteomës CSF. Rreshti i dytë përshkruan se mbivendosja midis moduleve të trurit dhe proteinës CSF (e hijezuar në të kuqe) është e rregulluar ndjeshëm në AD (P <0.05). Rreshti i tretë tregon se mbivendosja midis moduleve të trurit dhe proteinës CSF (hije blu) është e rregulluar ndjeshëm në AD (P <0.05). Përdorni metodën BH për të korrigjuar vlerën P që rrjedh nga FET. (D) Paneli i palosshëm i modulit bazuar në lidhjen e llojit të qelizës dhe termat përkatës GO. Këto panele përmbajnë gjithsej 271 proteina të lidhura me trurin, të cilat kanë shprehje diferenciale domethënëse në proteomën CSF.
Duke përdorur FET me një bisht të vetëm, ne vlerësuam rëndësinë e mbivendosjes së proteinave midis proteomës CSF dhe moduleve individuale të trurit. Analiza zbuloi se gjithsej 14 module të trurit në grupin e të dhënave CSF kanë mbivendosje statistikisht domethënëse (P <0.05 e rregulluar me FDR) dhe një modul shtesë (M18) mbivendosja e të cilit është afër rëndësisë (P = 0.06 e rregulluar FDR) (Figura 4C , rreshti i sipërm). Ne jemi gjithashtu të interesuar për modulet që mbivendosen fuqishëm me proteinat CSF të shprehura në mënyrë diferenciale. Prandaj, ne aplikuam dy analiza shtesë FET për të përcaktuar se cila prej (i) proteinave CSF u rrit ndjeshëm në AD dhe (ii) proteina CSF u ul ndjeshëm në AD (P <0.05, testi t çift AD/kontrolli) Modulet e trurit me mbivendosje kuptimplote mes tyre. Siç tregohet në rreshtat e mesit dhe të poshtëm të figurës 4C, këto analiza shtesë tregojnë se 8 nga 44 modulet e trurit mbivendosen ndjeshëm me proteinën e shtuar në AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 dhe M38) . ), ndërsa vetëm dy module (M6 dhe M15) treguan një mbivendosje domethënëse me proteinën e reduktuar në AD CSF. Siç pritej, të 10 modulet janë në 15 modulet me mbivendosjen më të lartë me proteomën CSF. Prandaj, ne supozojmë se këto 15 module janë burime me rendiment të lartë të biomarkerëve CSF që rrjedhin nga truri AD.
Ne i palosëm këto 15 module të mbivendosura në pesë panele të mëdha proteinash bazuar në afërsinë e tyre në diagramin e pemës WGCNA dhe lidhjen e tyre me llojet e qelizave dhe ontologjinë e gjeneve (Figura 4D). Paneli i parë përmban module të pasura me shënues neuronesh dhe proteina të lidhura me sinapset (M1 dhe M12). Paneli sinaptik përmban gjithsej 94 proteina dhe nivelet në proteomën CSF kanë ndryshuar ndjeshëm, duke e bërë atë burimin më të madh të shënuesve CSF të lidhura me trurin midis pesë paneleve. Grupi i dytë (M6 dhe M15) demonstroi lidhjen e ngushtë me shënuesit e qelizave endoteliale dhe trupin vaskular, si "shërimi i plagës" (M6) dhe "rregullimi i përgjigjes imune humorale" (M15). M15 është gjithashtu shumë i lidhur me metabolizmin e lipoproteinave, i cili është i lidhur ngushtë me endotelin (36). Paneli vaskular përmban 34 shënues CSF që lidhen me trurin. Në grupin e tretë përfshihen modulet (M2 dhe M4) që lidhen ndjeshëm me shënuesit e oligodendrociteve dhe proliferimin e qelizave. Për shembull, termat ontologjikë të nivelit të lartë të M2 përfshijnë "rregullimin pozitiv të replikimit të ADN-së" dhe "procesin e biosintezës së purinës". Ndërkohë, ato të M4 përfshijnë “diferencimin e qelizave gliale” dhe “ndarjen e kromozomeve”. Paneli i mielinimit përmban 49 shënues CSF që lidhen me trurin.
Grupi i katërt përmban shumicën e moduleve (M30, M29, M18, M24 dhe M5), dhe pothuajse të gjitha modulet janë dukshëm të pasura me mikroglia dhe shënues të astrociteve. Ngjashëm me panelin e mielinimit, paneli i katërt përmban gjithashtu module (M30, M29 dhe M18) që janë të lidhura ngushtë me përhapjen e qelizave. Modulet e tjera në këtë grup janë shumë të lidhura me termat imunologjikë, si "procesi i efektit imunitar" (M5) dhe "rregullimi i përgjigjes imune" (M24). Grupi imunitar glial përmban 42 shënues CSF që lidhen me trurin. Së fundi, paneli i fundit përfshin 52 shënues të lidhur me trurin në katër modulet (M44, M3, M33 dhe M38), të cilët janë të gjithë në trup në lidhje me ruajtjen e energjisë dhe metabolizmin. Më i madhi prej këtyre moduleve (M3) është i lidhur ngushtë me mitokondritë dhe është i pasur me shënues specifikë të neuroneve. M38 është një nga anëtarët më të vegjël të modulit në këtë metabolom dhe gjithashtu shfaq specifikë të moderuar të neuroneve.
Në përgjithësi, këto pesë panele pasqyrojnë një gamë të gjerë të llojeve dhe funksioneve të qelizave në korteksin AD, dhe së bashku përmbajnë 271 shënues CSF të lidhura me trurin (Tabela S2G). Për të vlerësuar vlefshmërinë e këtyre rezultateve të MS, ne përdorëm analizën e shtrirjes së afërsisë (PEA), një teknologji ortogonale e bazuar në antitrupa me aftësi multipleksimi, ndjeshmëri dhe specifikë të lartë, dhe rianalizuam mostrat e lëngut cerebrospinal që gjetëm një nëngrup të këtyre 271 biomarkerëve. (n = 36). Këto 36 objektiva demonstrojnë ndryshimin në shumëfishin AD të PEA, i cili është i lidhur ngushtë me gjetjet tona të bazuara në MS (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), të cilat verifikuan fuqishëm rezultatet e analizës sonë gjithëpërfshirëse të MS (Figura S4 ).
Temat biologjike të theksuara nga pesë grupet tona, nga sinjalizimi sinaptik te metabolizmi i energjisë, janë të gjitha të lidhura me patogjenezën e AD (1-3). Prandaj, të 15 modulet që përmbajnë këto panele janë të lidhura me patologjinë AD në proteomën e trurit që kemi zbuluar (Figura 2B). Më e dukshme është korrelacioni i lartë pozitiv patologjik midis moduleve tona gliale dhe korrelacioni i fortë patologjik negativ midis moduleve tona më të mëdha neuronale (M1 dhe M3). Analiza e shprehjes diferenciale e proteomës sonë të përsëritur të trurit (Figura S3D) thekson gjithashtu proteinat gliale të rrjedhura nga M5 dhe M18. Në AsymAD dhe AD simptomatike, proteinat gliale më të rritura dhe sinapset e lidhura me M1. Proteina reduktohet më së shumti. Këto vëzhgime tregojnë se 271 shënuesit e lëngut cerebrospinal që kemi identifikuar në pesë grupet janë të lidhura me proceset e sëmundjes në korteksin AD, duke përfshirë ato që ndodhin në fazat e hershme asimptomatike.
Për të analizuar më mirë drejtimin e ndryshimit të proteinave të panelit në tru dhe lëngun kurrizor, ne vizatuam sa vijon për secilin nga 15 modulet e mbivendosura: (i) gjetëm nivelin e bollëkut të modulit në grupin e të dhënave të trurit dhe (ii) modulin proteina Diferenca shprehet në lëngun cerebrospinal (Figura S5). Siç u përmend më herët, WGCNA përdoret për të përcaktuar bollëkun e modulit ose vlerën karakteristike të proteinave në tru (13). Harta e vullkanit përdoret për të përshkruar shprehjen diferenciale të proteinave modulare në lëngun cerebrospinal (AD/kontroll). Këto shifra tregojnë se tre nga pesë panelet tregojnë tendenca të ndryshme të shprehjes në tru dhe lëngun kurrizor. Dy modulet e panelit të sinapsit (M1 dhe M12) tregojnë një ulje të nivelit të bollëkut në trurin AD, por mbivendosen ndjeshëm me rritjen e proteinës në CSF AD (Figura S5A). Modulet e lidhura me neuronet që përmbajnë metabolomën (M3 dhe M38) treguan modele të ngjashme të shprehjes së trurit dhe lëngut cerebrospinal të paqëndrueshme (Figura S5E). Paneli vaskular gjithashtu tregoi tendenca të ndryshme të shprehjes, megjithëse modulet e tij (M6 dhe M15) u rritën mesatarisht në trurin AD dhe u ulën në CSF të sëmurë (Figura S5B). Dy panelet e mbetura përmbajnë rrjete të mëdha gliale, proteinat e të cilave rregullohen vazhdimisht në të dy ndarjet (Figura S5, C dhe D).
Ju lutemi vini re se këto tendenca nuk janë të zakonshme për të gjithë shënuesit në këto panele. Për shembull, paneli sinaptik përfshin disa proteina që reduktohen ndjeshëm në trurin AD dhe CSF (Figura S5A). Midis këtyre shënuesve të lëngut cerebrospinal të rregulluar poshtë janë NPTX2 dhe VGF e M1, dhe kromogranina B e M12. Megjithatë, pavarësisht nga këto përjashtime, shumica e shënuesve tanë sinaptikë janë të ngritur në lëngun kurrizor AD. Në përgjithësi, këto analiza ishin në gjendje të dallonin tendencat statistikisht të rëndësishme në nivelet e trurit dhe lëngut cerebrospinal në secilin nga pesë panelet tona. Këto tendenca nxjerrin në pah marrëdhënien komplekse dhe shpesh të ndryshme midis shprehjes së proteinave të trurit dhe CSF në AD.
Më pas, ne përdorëm analizën e replikimit të MS me performancë të lartë (përsëritja CSF 1) për të ngushtuar grupin tonë të 271 biomarkerëve në objektivat më premtues dhe të riprodhueshëm (Figura 5A). Kopja 1 e CSF përmban gjithsej 96 mostra nga Emory Goizueta ADRC, duke përfshirë kontrollin, AsymAD dhe grupin AD (Tabela S1A). Këto raste të AD karakterizohen nga një rënie e lehtë njohëse (mesatarja e MCA, 20,0 ± 3,8) dhe ndryshimet në biomarkerët e AD të konfirmuara në lëngun cerebrospinal (Tabela S1A). Ndryshe nga analiza e CSF që gjetëm, ky riprodhim kryhet duke përdorur një metodë më efikase dhe me performancë të lartë "single-shot" MS (pa fraksionim off-line), duke përfshirë një protokoll të thjeshtuar të përgatitjes së mostrës që eliminon nevojën për imunodepletim të mostrave individuale. . Në vend të kësaj, përdoret një "kanal i vetëm rritjes" i varfëruar nga imuniteti për të përforcuar sinjalin e proteinave më pak të bollshme (37). Megjithëse zvogëlon mbulimin total të proteomeve, kjo metodë me një goditje të vetme redukton ndjeshëm kohën e makinës dhe rrit numrin e mostrave të etiketuara me TMT që mund të analizohen të zbatueshme (17, 38). Në total, analiza identifikoi 6,487 peptide, të cilat u përcaktuan në 1,183 proteome në 96 raste. Ashtu si me analizën CSF që gjetëm, vetëm ato proteina të përcaktuara në sasi në të paktën 50% të mostrave u përfshinë në llogaritjet pasuese dhe të dhënat u regresuan për efektet e moshës dhe gjinisë. Kjo çoi në kuantifikimin përfundimtar të 792 proteomeve, 95% e të cilave u identifikuan gjithashtu në grupin e të dhënave CSF të gjetur.
(A) Objektivat e proteinave CSF të lidhura me trurin, të verifikuara në grupin e parë të përsëritur të CSF dhe të përfshira në panelin përfundimtar (n = 60). (B deri E) Nivelet e biomarkerëve të panelit (rezultatet e përbëra z) të matura në katër grupet e përsëritjes së CSF. T-testet e çiftuara ose ANOVA me post-korrigjimin e Tukey u përdorën për të vlerësuar rëndësinë statistikore të ndryshimeve në bollëk në secilën analizë të përsëritur. CT, kontroll.
Meqenëse ne jemi veçanërisht të interesuar në verifikimin e 271 objektivave tona të CSF të lidhura me trurin përmes analizës gjithëpërfshirëse, ne do të kufizojmë ekzaminimin e mëtejshëm të këtij proteome të përsëritur në këta shënues. Midis këtyre 271 proteinave, 100 u zbuluan në replikimin e CSF 1. Figura S6A tregon shprehjen diferenciale të këtyre 100 shënuesve të mbivendosur midis mostrave të kontrollit dhe replikimit të AD. Histonet sinaptike dhe metabolite rriten më shumë në AD, ndërsa proteinat vaskulare ulen më shumë në sëmundje. Shumica e 100 shënuesve të mbivendosur (n = 70) ruajtën të njëjtin drejtim ndryshimi në të dy grupet e të dhënave (Figura S6B). Këta 70 shënues CSF të vërtetuar të lidhur me trurin (Tabela S2H) pasqyrojnë kryesisht tendencat e shprehura të panelit të vëzhguara më parë, domethënë uljen e rregullimit të proteinave vaskulare dhe rregullimin lart të të gjitha paneleve të tjera. Vetëm 10 nga këto 70 proteina të vërtetuara treguan ndryshime në bollëkun e AD që kundërshtonin këto tendenca të panelit. Për të gjeneruar një panel që pasqyron më së miri trendin e përgjithshëm të trurit dhe lëngut cerebrospinal, ne i përjashtuam këto 10 proteina nga paneli me interes që verifikuam përfundimisht (Figura 5A). Prandaj, paneli ynë përfundimisht përfshin një total prej 60 proteinash të verifikuara në dy grupe të pavarura AD CSF duke përdorur përgatitje të ndryshme të mostrës dhe analiza të platformës MS. Grafikët e shprehjes me rezultatin z të këtyre paneleve përfundimtare në rastet e kontrollit të kopjes 1 të CSF dhe AD konfirmuan tendencën e panelit të vërejtur në grupin CSF që gjetëm (Figura 5B).
Midis këtyre 60 proteinave, ka molekula të njohura si të lidhura me AD, të tilla si osteopontina (SPP1), e cila është një citokinë pro-inflamatore që është shoqëruar me AD në shumë studime (39-41), dhe GAP43, një proteinë sinaptike. që lidhet qartë me neurodegjenerimin (42). Proteinat më të verifikuara plotësisht janë shënuesit që lidhen me sëmundje të tjera neurodegjenerative, të tilla si skleroza laterale amiotrofike (ALS) e lidhur me superoksid dismutazën 1 (SOD1) dhe desakarazën e lidhur me sëmundjen e Parkinsonit (PARK7). Ne kemi verifikuar gjithashtu se shumë shënues të tjerë, si SMOC1 dhe proteina sinjalizuese e lidhjes së membranës së pasur me trurin 1 (BASP1), kanë kufizuar lidhjet e mëparshme me neurodegjenerimin. Vlen të përmendet se për shkak të bollëkut të tyre të ulët të përgjithshëm në proteomën CSF, është e vështirë për ne që të përdorim këtë metodë të zbulimit me një goditje me shpejtësi të lartë për të zbuluar me besueshmëri MAPT dhe disa proteina të tjera të lidhura me AD (për shembull, NEFL dhe NRGN ) ( 43, 44).
Më pas i kontrolluam këta 60 shënues të paneleve prioritare në tre analiza të përsëritura shtesë. Në CSF Copy 2, ne përdorëm një TMT-MS të vetme për të analizuar një grup të pavarur të 297 mostrave të kontrollit dhe AD nga Emory Goizueta ADRC (17). Replikimi 3 i CSF përfshin një rianalizë të të dhënave të disponueshme TMT-MS nga 120 pacientë kontrolli dhe AD nga Lozana, Zvicër (45). Ne zbuluam më shumë se dy të tretat e 60 shënuesve prioritare në çdo grup të dhënash. Megjithëse studimi zviceran përdori platforma të ndryshme MS dhe metoda të kuantifikimit TMT (45, 46), ne riprodhuam fuqimisht tendencat tona të panelit në dy analiza të përsëritura (Figura 5, C dhe D, dhe Tabelat S2, I dhe J). Për të vlerësuar specifikën e sëmundjes së grupit tonë, ne përdorëm TMT-MS për të analizuar grupin e katërt të të dhënave të përsëritjes (përsëritja 4 CSF), e cila përfshinte jo vetëm rastet e kontrollit (n = 18) dhe AD (n = 17), por edhe PD ( n = 14)), ALS (n = 18) dhe mostra të demencës frontotemporale (FTD) (n = 11) (Tabela S1A). Ne përcaktuam me sukses gati dy të tretat e proteinave të panelit në këtë grup (38 nga 60). Këto rezultate theksojnë ndryshimet specifike të AD në të pesë panelet e biomarkerëve (Figura 5E dhe Tabela S2K). Rritja në grupin e metabolitëve tregoi specifikën më të fortë të AD, e ndjekur nga grupi i mielinimit dhe glialit. Në një masë më të vogël, FTD tregon gjithashtu një rritje midis këtyre paneleve, të cilat mund të pasqyrojnë ndryshime të ngjashme të mundshme të rrjetit (17). Në të kundërt, ALS dhe PD treguan pothuajse të njëjtat profile të mielinimit, glialit dhe metabolomit si grupi i kontrollit. Në përgjithësi, pavarësisht dallimeve në përgatitjen e mostrës, platformën MS dhe metodat e kuantifikimit TMT, këto analiza të përsëritura tregojnë se shënuesit tanë të panelit prioritar kanë ndryshime shumë të qëndrueshme specifike të AD në më shumë se 500 mostra unike CSF.
Neurodegjenerimi AD është njohur gjerësisht disa vite përpara fillimit të simptomave njohëse, kështu që ekziston një nevojë urgjente për biomarkerët e AsymAD (5, 31). Sidoqoftë, gjithnjë e më shumë prova tregojnë se biologjia e AsymAD nuk është aspak homogjene, dhe ndërveprimi kompleks i rrezikut dhe elasticitetit çon në dallime të mëdha individuale në përparimin e mëvonshëm të sëmundjes (47). Edhe pse përdoret për të identifikuar rastet e AsymAD, nivelet e biomarkerëve bazë të CSF (Aβ1-42, tau total dhe p-tau) nuk janë provuar të jenë në gjendje të parashikojnë me besueshmëri se kush do të përparojë në demencë (4, 7), duke treguar më shumë. e nevojshme për të përfshirë mjete holistike të biomarkerëve të bazuar në aspekte të shumta të fiziologjisë së trurit për të shtresuar me saktësi rrezikun e kësaj popullate. Prandaj, ne analizuam më pas panelin tonë të biomarkerëve të vërtetuar me AD në popullatën AsymAD të kopjes 1 të CSF. Këto 31 raste AsymAD treguan nivele anormale të biomarkerëve bazë (Aβ1–42/raporti total tau ELISA, <5.5) dhe njohje të plotë (mesatarja e MCA, 271. ± 2.2) (Tabela S1A). Për më tepër, të gjithë individët me AsymAD kanë një rezultat klinik të çmendurisë prej 0, që tregon se nuk ka dëshmi të një rënie në performancën ditore njohëse ose funksionale.
Ne fillimisht analizuam nivelet e paneleve të vërtetuara në të 96 replikat CSF 1, duke përfshirë grupin AsymAD. Ne zbuluam se disa panele në grupin AsymAD kishin ndryshime të rëndësishme të bollëkut të ngjashëm me AD, paneli vaskular tregoi një prirje rënëse në AsymAD, ndërsa të gjitha panelet e tjera treguan një prirje rritëse (Figura 6A). Prandaj, të gjitha panelet treguan një korrelacion shumë domethënës me ELISA Aβ1-42 dhe nivelet totale të tau (Figura 6B). Në të kundërt, korrelacioni midis grupit dhe rezultatit të MÇK-së është relativisht i dobët. Një nga gjetjet më të habitshme nga këto analiza është gama e madhe e bollëkut të paneleve në grupin AsymAD. Siç tregohet në figurën 6A, niveli i panelit të grupit AsymAD zakonisht kalon nivelin e panelit të grupit të kontrollit dhe grupit AD, duke treguar ndryshueshmëri relativisht të lartë. Për të eksploruar më tej këtë heterogjenitet të AsymAD, ne aplikuam analizën e shkallëzimit shumëdimensional (MDS) në 96 raste të replikimit 1 CSF. Analiza MDS lejon të vizualizohet ngjashmëria midis rasteve bazuar në disa variabla në grupin e të dhënave. Për këtë analizë grupi, ne përdorim vetëm ata shënues të panelit të vlefshëm që kanë një ndryshim statistikisht domethënës (P <0.05, AD/kontroll) në nivelin e zbulimit dhe replikimit të CSF 1 (n = 29) (Tabela S2L). Kjo analizë prodhoi një grupim të qartë hapësinor midis rasteve të kontrollit tonë dhe AD (Figura 6C). Në të kundërt, disa raste AsymAD janë të grupuara qartë në grupin e kontrollit, ndërsa të tjerat janë të vendosura në rastet AD. Për të eksploruar më tej këtë heterogjenitet AsymAD, ne përdorëm hartën tonë MDS për të përcaktuar dy grupe të këtyre rasteve AsymAD. Grupi i parë përfshinte rastet AsymAD të grumbulluara më afër kontrollit (n = 19), ndërsa grupi i dytë u karakterizua nga raste AsymAD me një profil shënues më afër AD (n = 12).
(A) Niveli i shprehjes (z-rezultati) i grupit të biomarkerëve CSF në të 96 mostrat në grupin e replikimit 1 CSF, duke përfshirë AsymAD. Analiza e variancës me paskorrigjimin e Tukey u përdor për të vlerësuar rëndësinë statistikore të ndryshimeve të bollëkut të panelit. (B) Analiza e korrelacionit të nivelit të bollëkut të proteinave të panelit (z-rezultati) me rezultatin e MoCA dhe nivelin total të tau në mostrat ELISA Aβ1-42 dhe CSF kopje 1. Shfaqet koeficienti i korrelacionit Pearson me vlerën përkatëse P. (C) MDS e 96 rasteve të kopjes 1 CSF u bazua në nivelet e bollëkut të 29 shënuesve të panelit të vlefshëm, të cilët u ndryshuan ndjeshëm në grupet e të dhënave të zbulimit dhe kopjes CSF 1 [P <0,05 AD/kontroll (CT)]. Kjo analizë u përdor për të ndarë grupin AsymAD në nëngrupet e kontrollit (n = 19) dhe AD (n = 12). (D) Grafiku i vullkanit tregon shprehjen diferenciale të të gjitha proteinave të replikimit 1 CSF me ndryshim log2 fish (boshti x) në lidhje me vlerën statistikore P -log10 midis dy nëngrupeve AsymAD. Biomarkerët e panelit janë me ngjyra. (E) Niveli i bollëkut të replikimit 1 të CSF të biomarkerëve të grupit të përzgjedhjes shprehet në mënyrë të ndryshme midis nëngrupeve AsymAD. Analiza e variancës e pas-rregulluar e Tukey u përdor për të vlerësuar rëndësinë statistikore.
Ne ekzaminuam shprehjen diferenciale të proteinave midis këtyre rasteve të kontrollit dhe rasteve AsymAD të ngjashme me AD (Figura 6D dhe Tabela S2L). Harta e vullkanit që rezulton tregon se 14 shënues panelesh kanë ndryshuar ndjeshëm midis dy grupeve. Shumica e këtyre shënuesve janë anëtarë të sinapsit dhe metabolomit. Megjithatë, SOD1 dhe substrati i proteinës kinazës C të pasur me alaninë të miristojiluar (MARCKS), të cilët janë përkatësisht anëtarë të grupeve imune të mielinës dhe gliale, gjithashtu i përkasin këtij grupi (Figura 6, D dhe E). Paneli vaskular kontribuoi gjithashtu me dy shënues që u reduktuan ndjeshëm në grupin AsymAD të ngjashëm me AD, duke përfshirë proteinën lidhëse AE 1 (AEBP1) dhe anëtarin e familjes së komplementit C9. Nuk kishte asnjë ndryshim domethënës midis nëngrupeve AsymAD të kontrollit dhe të ngjashëm me AD në ELISA AB1-42 (P = 0.38) dhe p-tau (P = 0.28), por kishte vërtet një ndryshim domethënës në nivelin total të tau (P = 0.0031 ) (Fig. S7). Ka disa shënues panelesh që tregojnë se ndryshimet midis dy nëngrupeve AsymAD janë më domethënëse sesa nivelet totale të tau (për shembull, YWHAZ, SOD1 dhe MDH1) (Figura 6E). Në përgjithësi, këto rezultate tregojnë se paneli ynë i vlefshëm mund të përmbajë biomarkera që mund të nëntipojnë dhe shtresojnë rrezikun e mundshëm të pacientëve me sëmundje asimptomatike.
Ekziston një nevojë urgjente për mjete biomarkerësh të bazuara në sistem për të matur dhe synuar më mirë patofiziologjinë e ndryshme pas AD. Këto mjete pritet që jo vetëm të ndryshojnë kuadrin tonë diagnostikues të AD, por gjithashtu të nxisin miratimin e strategjive efektive të trajtimit të pacientit (1, 2). Për këtë qëllim, ne aplikuam një qasje të paanshme gjithëpërfshirëse të proteomikës për trurin AD dhe CSF për të identifikuar biomarkerët CSF të bazuara në ueb që pasqyrojnë një gamë të gjerë të patofiziologjisë së bazuar në tru. Analiza jonë prodhoi pesë panele biomarkerësh CSF, të cilat (i) pasqyrojnë sinapset, enët e gjakut, mielinën, mosfunksionimin imunitar dhe metabolik; (ii) demonstrojnë riprodhueshmëri të fortë në platforma të ndryshme MS; (iii) Tregoni ndryshime progresive specifike të sëmundjes përgjatë fazave të hershme dhe të vonshme të AD. Në përgjithësi, këto gjetje përfaqësojnë një hap premtues drejt zhvillimit të mjeteve të larmishme, të besueshme, të orientuara nga ueb-biomarker për kërkimin e AD dhe aplikimet klinike.
Rezultatet tona demonstrojnë organizimin shumë të ruajtur të proteomës së rrjetit të trurit AD dhe mbështesin përdorimin e tij si një ankorë për zhvillimin e biomarkerëve të bazuar në sistem. Analiza jonë tregon se dy grupe të dhënash të pavarura TMT-MS që përmbajnë trurin AD dhe AsymAD kanë modularitet të fortë. Këto gjetje zgjerojnë punën tonë të mëparshme, duke demonstruar ruajtjen e moduleve të fuqishme të më shumë se 2,000 indeve të trurit nga grupe të shumta të pavarura në korteksin frontal, parietal dhe temporal (17). Ky rrjet konsensusi pasqyron ndryshime të ndryshme të lidhura me sëmundjet e vërejtura në kërkimet aktuale, duke përfshirë rritjen e moduleve inflamatore të pasura me gliale dhe uljen e moduleve të pasura me neurone. Ashtu si kërkimet aktuale, ky rrjet në shkallë të gjerë gjithashtu përmban ndryshime të rëndësishme modulare në AsymAD, duke treguar një shumëllojshmëri të patofiziologjisë së ndryshme paraklinike (17).
Megjithatë, brenda këtij kuadri shumë konservator të bazuar në sistem, ka më shumë heterogjenitet biologjik të hollësishëm, veçanërisht midis individëve në fazat e hershme të AD. Paneli ynë i biomarkerëve është në gjendje të përshkruaj dy nëngrupe në AsymAD, të cilat demonstrojnë shprehjen diferenciale të rëndësishme të shënuesve të shumtë CSF. Grupi ynë ishte në gjendje të nxjerrë në pah ndryshimet biologjike midis këtyre dy nëngrupeve, të cilat nuk ishin të dukshme në nivelin e biomarkerëve bazë të AD. Krahasuar me grupin e kontrollit, raportet Aβ1-42/tau totale e këtyre individëve AsymAD ishin anormalisht të ulëta. Sidoqoftë, vetëm nivelet totale të tau ishin dukshëm të ndryshme midis dy nëngrupeve AsymAD, ndërsa nivelet Aβ1-42 dhe p-tau mbetën relativisht të krahasueshme. Meqenëse tau i lartë CSF duket të jetë një parashikues më i mirë i simptomave njohëse sesa nivelet Aβ1-42 (7), ne dyshojmë se dy grupet e AsymAD mund të kenë rreziqe të ndryshme të përparimit të sëmundjes. Duke pasur parasysh madhësinë e kufizuar të kampionit të AsymAD tonë dhe mungesën e të dhënave gjatësore, nevojiten kërkime të mëtejshme për të nxjerrë me siguri këto përfundime. Megjithatë, këto rezultate tregojnë se një panel CSF i bazuar në sistem mund të rrisë aftësinë tonë për të shtresuar në mënyrë efektive individët gjatë fazës asimptomatike të sëmundjes.
Në përgjithësi, gjetjet tona mbështesin rolin e funksioneve të shumta biologjike në patogjenezën e AD. Megjithatë, metabolizmi i çrregulluar i energjisë u bë tema kryesore e të pesë paneleve tona të vërtetuara të etiketimit. Proteinat metabolike, të tilla si hipoksantinë-guaninë fosforiboziltransferaza 1 (HPRT1) dhe laktat dehidrogjenaza A (LDHA), janë biomarkerët sinaptikë më të vlefshëm, që tregojnë se rritja e AD CSF është seksi shumë i riprodhueshëm. Enët tona të gjakut dhe panelet gliale përmbajnë gjithashtu disa shënues të përfshirë në metabolizmin e substancave oksiduese. Këto gjetje janë në përputhje me rolin kyç që luajnë proceset metabolike në të gjithë trurin, jo vetëm për të përmbushur kërkesën e lartë të energjisë së neuroneve, por edhe për të përmbushur kërkesën e lartë për energji të astrociteve dhe qelizave të tjera gliale (17, 48). Rezultatet tona mbështesin provat në rritje se ndryshimet në potencialin redoks dhe ndërprerja e rrugëve të energjisë mund të jenë lidhja thelbësore midis disa proceseve kyçe të përfshira në patogjenezën e AD, duke përfshirë çrregullimet mitokondriale, inflamacionin e ndërmjetësuar nga glia dhe dëmtimin vaskular (49). Përveç kësaj, biomarkerët metabolikë të lëngut cerebrospinal përmbajnë një numër të madh proteinash të pasura në mënyrë diferenciale midis nëngrupeve tona të kontrollit dhe AsymAD të ngjashme me AD, duke sugjeruar se ndërprerja e këtyre rrugëve të energjisë dhe redoksit mund të jetë kritike në fazën paraklinike të sëmundjes.
Tendencat e ndryshme të panelit të trurit dhe lëngut cerebrospinal që kemi vëzhguar kanë gjithashtu implikime biologjike interesante. Sinapsat dhe metabolomet e pasura me neurone tregojnë ulje të niveleve në trurin e AD dhe rritje të bollëkut në lëngun cerebrospinal. Duke pasur parasysh që neuronet janë të pasura me mitokondri që prodhojnë energji në sinapse për të siguruar energji për sinjalet e tyre të shumta të specializuara (50), pritet ngjashmëria e profileve të shprehjes së këtyre dy grupeve neurone. Humbja e neuroneve dhe nxjerrja e qelizave të dëmtuara mund të shpjegojë këto tendenca të panelit të trurit dhe CSF në sëmundjet e mëvonshme, por ato nuk mund të shpjegojnë ndryshimet e hershme të panelit që vëzhgojmë (13). Një shpjegim i mundshëm për këto gjetje në sëmundjen e hershme asimptomatike është krasitja jonormale sinaptike. Provat e reja në modelet e miut sugjerojnë se fagocitoza sinaptike e ndërmjetësuar nga mikroglia mund të aktivizohet në mënyrë jonormale në AD dhe të çojë në humbjen e hershme të sinapsit në tru (51). Ky material sinaptik i hedhur poshtë mund të grumbullohet në CSF, kjo është arsyeja pse ne vëzhgojmë rritjen e CSF në panelin e neuroneve. Krasitja sinaptike e ndërmjetësuar nga imuniteti mund të shpjegojë gjithashtu pjesërisht rritjen e proteinave gliale që vërejmë në tru dhe lëngun cerebrospinal gjatë gjithë procesit të sëmundjes. Përveç krasitjes sinaptike, anomalitë e përgjithshme në shtegun ekzocitik mund të çojnë gjithashtu në shprehje të ndryshme të trurit dhe CSF të shënuesve neuronalë. Një numër studimesh kanë treguar se përmbajtja e ekzosomeve në patogjenezën e trurit të AD ka ndryshuar (52). Rruga jashtëqelizore është gjithashtu e përfshirë në përhapjen e Aβ (53, 54). Vlen të përmendet se shtypja e sekretimit ekzosomal mund të zvogëlojë patologjinë e ngjashme me AD në modelet transgjenike të miut AD (55).
Në të njëjtën kohë, proteina në panelin vaskular tregoi një rritje të moderuar në trurin AD, por u ul ndjeshëm në CSF. Mosfunksionimi i barrierës gjaku-tru (BBB) mund të shpjegojë pjesërisht këto gjetje. Shumë studime të pavarura pas vdekjes njerëzore kanë demonstruar ndarje të BBB në AD (56, 57). Këto studime konfirmuan aktivitete të ndryshme jonormale që rrethojnë këtë shtresë të mbyllur fort të qelizave endoteliale, duke përfshirë rrjedhjen e kapilarëve të trurit dhe akumulimin perivascular të proteinave të transmetuara nga gjaku (57). Kjo mund të ofrojë një shpjegim të thjeshtë për proteinat e ngritura vaskulare në tru, por nuk mund të shpjegojë plotësisht varfërimin e të njëjtave proteina në lëngun cerebrospinal. Një mundësi është që sistemi nervor qendror të izolojë në mënyrë aktive këto molekula për të zgjidhur problemin e rritjes së inflamacionit dhe stresit oksidativ. Reduktimi i disa prej proteinave më të rënda të CSF në këtë panel, veçanërisht ato të përfshira në rregullimin e lipoproteinave, lidhet me frenimin e niveleve të dëmshme të inflamacionit dhe procesin neuroprotektiv të specieve reaktive të oksigjenit. Kjo është e vërtetë për Paroxonase 1 (PON1), një enzimë lidhëse e lipoproteinës përgjegjëse për reduktimin e niveleve të stresit oksidativ në qarkullim (58, 59). Pararendësi i alfa-1-mikroglobulinës/bikuninës (AMBP) është një tjetër shënues i ulur ndjeshëm i grupit vaskular. Është pararendës i transportuesit të lipideve bikunin, i cili gjithashtu është i përfshirë në shtypjen e inflamacionit dhe mbrojtjen neurologjike (60, 61).
Pavarësisht hipotezave të ndryshme interesante, pamundësia për të zbuluar drejtpërdrejt mekanizmat e sëmundjes biokimike është një kufizim i njohur i analizës proteomike të drejtuar nga zbulimi. Prandaj, kërkime të mëtejshme janë të nevojshme për të përcaktuar me siguri mekanizmat që qëndrojnë pas këtyre paneleve të biomarkerëve. Për të ecur drejt zhvillimit të analizave klinike të bazuara në MS, drejtimi i ardhshëm kërkon gjithashtu përdorimin e metodave sasiore të synuara për verifikimin e biomarkerëve në shkallë të gjerë, siç është monitorimi i reagimit selektiv ose paralel (62). Kohët e fundit kemi përdorur monitorimin e reagimit paralel (63) për të vërtetuar shumë nga ndryshimet e proteinave CSF të përshkruara këtu. Disa objektiva të paneleve prioritare përcaktohen me saktësi të konsiderueshme, duke përfshirë YWHAZ, ALDOA dhe SMOC1, të cilat hartohen në panelet tona të sinapsit, metabolizmit dhe inflamacionit, përkatësisht (63). Përvetësimi i pavarur i të dhënave (DIA) dhe strategji të tjera të bazuara në MS mund të jenë gjithashtu të dobishme për verifikimin e objektivit. Bud et al. (64) Kohët e fundit u demonstrua se ka një mbivendosje të konsiderueshme midis biomarkerëve AD të identifikuar në grupin tonë të të dhënave të zbulimit të CSF dhe grupit të pavarur të të dhënave DIA-MS, i cili përbëhet nga afro 200 mostra CSF nga tre grupe të ndryshme evropiane. Këto studime të fundit mbështesin potencialin e paneleve tona për t'u shndërruar në zbulim të besueshëm të bazuar në MS. Zbulimi tradicional i antitrupave dhe aptamerëve është gjithashtu i rëndësishëm për zhvillimin e mëtejshëm të biomarkerëve kryesorë të AD. Për shkak të bollëkut të ulët të CSF, është më e vështirë të zbulohen këta biomarkues duke përdorur metoda të MS me performancë të lartë. NEFL dhe NRGN janë dy shembuj të tillë të biomarkerëve CSF me bollëk të ulët, të cilët janë paraqitur në panel në analizën tonë gjithëpërfshirëse, por nuk mund të zbulohen me besueshmëri duke përdorur strategjinë tonë të vetme MS. Strategjitë e synimit të bazuara në antitrupa të shumtë, si PEA, mund të nxisin transformimin klinik të këtyre shënuesve.
Në përgjithësi, ky studim ofron një qasje unike proteomike për identifikimin dhe verifikimin e biomarkerëve AD CSF bazuar në sisteme të ndryshme. Optimizimi i këtyre paneleve të shënuesve në grupet shtesë të AD dhe platformat MS mund të jetë premtues për të avancuar shtresimin dhe trajtimin e rrezikut të AD. Studimet që vlerësojnë nivelin gjatësor të këtyre paneleve me kalimin e kohës janë gjithashtu kritike për të përcaktuar se cili kombinim i shënuesve shtreson më mirë rrezikun e sëmundjes së hershme dhe ndryshimet në ashpërsinë e sëmundjes.
Përveç 3 mostrave të kopjuara nga CSF, të gjitha mostrat e CSF të përdorura në këtë studim u mblodhën nën kujdesin e Emory ADRC ose institucione kërkimore të lidhura ngushtë. Në këto studime proteomike u përdorën gjithsej katër grupe të mostrave të Emory CSF. U zbulua se grupi CSF përmban mostra nga 20 kontrolle të shëndetshme dhe 20 pacientë me AD. Kopja 1 e CSF përfshin mostra nga 32 kontrolle të shëndetshme, 31 individë AsymAD dhe 33 individë AD. Kopja 2 e CSF përmban 147 kontrolle dhe 150 mostra pas Krishtit. Kohorta 4 e replikimit të CSF me shumë sëmundje përfshinte 18 kontrolle, 17 AD, 19 ALS, 13 PD dhe 11 mostra FTD. Sipas marrëveshjes së miratuar nga Bordi i Rishikimit Institucional të Universitetit Emory, të gjithë pjesëmarrësit e studimit Emory morën pëlqimin e informuar. Sipas udhëzimeve të praktikave më të mira të Institutit Kombëtar të Plakjes 2014 për Qendrat e Alzheimerit (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), lëngu cerebrospinal u mblodh dhe u ruajt me punksion lumbal. Pacientët e kontrollit dhe AsymAD dhe AD morën vlerësim të standardizuar njohës në Klinikën e Neurologjisë Kognitive Emory ose Goizueta ADRC. Mostrat e tyre të lëngut cerebrospinal u testuan nga INNO-BIA AlzBio3 Luminex për ELISA Aβ1-42, analiza totale tau dhe p-tau (65). Vlerat ELISA përdoren për të mbështetur klasifikimin diagnostik të subjekteve bazuar në kriteret e përcaktuara të prerjes së biomarkerëve AD (66, 67). Të dhënat bazë demografike dhe diagnostike për diagnoza të tjera CSF (FTD, ALS dhe PD) merren gjithashtu nga Emory ADRC ose institucione kërkimore të lidhura me to. Meta të dhënat përmbledhëse të rastit për këto raste Emory CSF mund të gjenden në Tabelën S1A. Karakteristikat e grupit 3 të përsëritjes së CSF-së zvicerane janë publikuar më parë (45).
CSF gjeti kampionin. Për të rritur thellësinë e zbulimit tonë të grupit të të dhënave CSF, konsumi imunitar i proteinave me bollëk të lartë u krye përpara tripsinizimit. Shkurtimisht, 130 μl CSF nga 40 mostra individuale të CSF dhe një vëllim i barabartë (130 μl) rrëshirë për zvogëlimin e proteinave me bollëk të lartë 14 (Thermo Fisher Scientific, A36372) u vendosën në një kolonë rrotullimi (Thermo Fisher Scientific, A89868) në dhomë. temperatura Inkub). Pas rrotullimit për 15 minuta, centrifugoni kampionin në 1000 g për 2 minuta. Një pajisje filtri ultracentrifugale 3K (Millipore, UFC500396) u përdor për të përqendruar kampionin e rrjedhës duke u centrifuguar në 14,000 g për 30 minuta. Holloni të gjitha vëllimet e mostrës në 75 μl me solucion fiziologjik të puferuar me fosfat. Përqendrimi i proteinave u vlerësua me metodën e acidit bicinkoninik (BCA) sipas protokollit të prodhuesit (Thermo Fisher Scientific). CSF i imunizuar (60 μl) nga të 40 mostrat u tret me lizil endopeptidazë (LysC) dhe tripsinë. Shkurtimisht, kampioni u reduktua dhe u alkilua me 1.2 μl 0.5 M tris-2(-karboksietil)-fosfinë dhe 3 μl 0.8 M kloroacetamid në 90°C për 10 minuta, dhe më pas u sonikua në një banjë uji për 15 minuta. Mostra u hollua me 193 μl bufer ure 8 M [8 M ure dhe 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] deri në një përqendrim përfundimtar prej 6 M ure. LysC (4.5 μg; Wako) përdoret për tretje gjatë natës në temperaturën e dhomës. Mostra më pas u hollua në 1 M ure me 50 mM bikarbonat amoniumi (ABC) (68). Shtoni një sasi të barabartë (4,5 μg) të tripsinës (Promega) dhe më pas inkuboni kampionin për 12 orë. Acidizoni tretësirën e peptidit të tretur në një përqendrim përfundimtar prej 1% acid formik (FA) dhe 0,1% acid trifluoroacetik (TFA) (66), dhe më pas çkriponi me një kolonë 50 mg Sep-Pak C18 (Ujërat) siç përshkruhet më sipër (25) . Më pas peptidi u eluat në 1 ml acetonitril 50% (ACN). Për të standardizuar sasinë e proteinave nëpër tufa (25), pjesë 100 μl nga të gjitha 40 mostrat CSF u kombinuan për të gjeneruar një mostër të përzier, e cila më pas u nda në pesë mostra të standardeve të brendshme globale (GIS) (48). Të gjitha mostrat individuale dhe standardet e kombinuara thahen me vakum me shpejtësi të lartë (Labconco).
CSF kopjon mostrën. Dayon dhe kolegët kanë përshkruar më parë dobësimin dhe tretjen e imunitetit të mostrave të kopjes 3 të CSF (45, 46). Mostrat e mbetura të përsëritura nuk ishin imunodeplotë individualisht. Tretni këto mostra të pa hequra në tripsinë siç përshkruhet më parë (17). Për çdo analizë të përsëritur, pjesë 120 μl të peptidit të elutur nga çdo mostër u grumbulluan së bashku dhe u ndanë në pjesë të barabarta të vëllimit për t'u përdorur si standardi i brendshëm global i etiketuar me TMT (48). Të gjitha mostrat individuale dhe standardet e kombinuara thahen me vakum me shpejtësi të lartë (Labconco). Për të rritur sinjalin e proteinës CSF me bollëk të ulët, duke kombinuar 125 μl nga çdo mostër, një mostër "e përmirësuar" u përgatit për çdo analizë të përsëritur [d.m.th., një mostër biologjike që imiton kampionin e kërkimit, por sasia e disponueshme është shumë më i madh (37, 69)] u bashkua në një mostër të përzier CSF (17). Mostra e përzier më pas u hoq me imunitet duke përdorur 12 ml rrëshirë për heqjen e proteinave me bollëk të lartë të përzgjedhur Top14 (Thermo Fisher Scientific, A36372), e tretur siç përshkruhet më sipër dhe u përfshi në etiketimin e shumëfishtë TMT pasues.
Koha e postimit: Gusht-27-2021